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三七总皂苷(Panax notoginseng total saponins, PNS)为四环三萜类物质,是三七主要的药用活性成分。研究表明三七总皂苷具有抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇以及提高机体免疫力等多种生物活性,是防治心脑血管疾病的重要药物。三七主要分布在我国云南文山,生长地域狭小,一般需生长3年以上方可入药,加上其生长条件严苛、病虫害、轮作、土地利用率低等因素的影响,市场供需矛盾突出。近年来,植物次级代谢途径的基因调控已成为分子生物学研究的热点与难点。随着植物三萜皂苷生物合成途径的明了化,使得通过代谢工程手段调控三七皂苷的生物合成成为可能。三七总皂苷和植物甾醇分别由达玛烯二醇合酶(DS)及环阿屯醇合酶(CAS)催化共同的前体物质2,3-氧化鲨烯合成。本研究通过RNAi技术抑制三七中CAS基因的表达,使代谢流可以更多的流向三萜皂苷合成途径,从而达到提高三七皂苷含量的目的。本文首先利用反转录PCR从三七总RNA中扩增出CAS基因RNAi片段,将其克隆到pMD18-T载体上。再以构建好的pMD18-T-CAS质粒DNA为模板,进行attB-PCR,使得RNAi片段的两端带有attB接头。随后,利用GatewayTM技术将带有attB接头的RNAi干扰片段以同源重组的方式克隆到双元表达载体pHellsgate2上,构建出RNAi表达载体pHellsgate-CAS。采用氯化钙冻融法将RNAi表达载体转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105感受态细胞中。利用根癌农杆菌介导法将外源基因导入并整合到三七基因组中,建立起基于三七愈伤组织的遗传转化体系。转化获得的愈伤组织在含卡那霉素的培养基上筛选,经过5次筛选之后选出8株生长较快且细胞状态良好的细胞系进行基因组DNA PCR,结果表明有5株细胞系(E5、E8、E16、E24、E30) PCR结果呈阳性,初步确定这5株细胞系为转基因阳性细胞系。利用荧光定量PCR技术检测5株转基因细胞系中CAS基因和DS基因表达量,发现除了细胞系E24外,其余4株转基因细胞系均表现为CAS基因表达量的下降和DS基因表达量的升高。为了进一步明确CAS基因在三七皂苷生物合成途径中的作用,对4株转基因阳性细胞系,进行三七总皂苷以及植物甾醇含量的检测,结果显示转基因细胞系中植物甾醇含量明显低于普通三七细胞系,而其皂苷含量则高于普通三七细胞系。三七中,几乎每种单体皂苷都具有其独特的药用价值,本研究检测9种主要单体皂苷(Re、Rb1、Rg1、Rg3、Rh2、 F2、Rh1、F1以及Rd)在转基因三七和普通三七细胞系中的含量。结果表明,除了单体皂苷Rd外其余单体皂苷含量均有不同程度的升高。研究结果表明CAS基因在三萜皂苷合成途径中发挥着重要调控作用,其表达量的降低有利于三七皂苷的积累。