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体细胞核移植作为生命科学的研究热点，已在多种哺乳动物研究上获得了令人瞩目的进展。然而传统的显微操作程序的总体效率相当低，而且操作程序复杂，需要一系列较昂贵的仪器设备，日常实验还需长期培训的技术人员，这就在一定程度上限制了该技术的广泛应用。最近几年发展起来的化学诱导去核技术和无透明带核移植技术分别从卵母细胞的去核和体细胞与卵母细胞的融合上简化了核移植程序，逐渐形成了一种新的核移植技术—无透明带手工核移植(hand-made cloning，HMC)。该技术完全做到手工操作，不仅省去了繁杂的显微操作步骤，大大降低了生产成本，而且由于去除了透明带，便于卵母细胞与供体细胞的融合，从而可以进一步提高核移植的成功率。因此，本研究以ICR小鼠卵母细胞为材料，将化学诱导去核技术和无透明带核移植技术相结合，进行了如下实验：
1.制备具有完整发育潜力的去核卵母细胞是体细胞核移植技术成功的关键。本研究在国内外己有的脱羰秋水仙碱(Demecolcine，DC)诱导去核技术路线的基础上，以ICR小鼠为材料，着重探讨了不同取卵时间、激活方法以及DC处理开始时间对诱导去核率的影响。实验结果显示，无论是经乙醇激活还是经SrCl2激活，hCG注射后17～18 h采集组的诱导去核率显著高于hCG注射后14～15 h和23～24 h采集组(p<0.05)，略低于hCG注射后20～21 h采集组，差异不显著(p>0.05)，而hCG注射后17～18 h采集组的激活卵的囊胚发育率显著高于其它各组(p<0.05)，SrCl2激活组的卵母细胞第二极体排出率随取卵时间的延长差异不显著(p>0.05)，而乙醇激活组的卵母细胞第二极体排出率随取卵时间的延长先升高后降低;hCG注射后相同时间采集的卵母细胞，经乙醇和SrCl2激活处理后的诱导去核率、第二极体排出率和囊胚发育率差异均不显著(p>0.05)，以SrCl2激活组略高；乙醇激活后0 min起始DC处理的诱导去核率显著高于激活后10 min和15 min起始DC处理组的诱导去核率(p<0.05)，略高于激活后5 min起始DC处理组的诱导去核率(p>0.05)；在10 mM SrCl2中激活15 min后起始DC处理的诱导去核率显著高于激活25 min和35 min后起始DC处理组的诱导去核率(p<0.05)，略高于激活后0 min起始DC处理组的诱导去核率(p>0.05)。实验结果表明，取卵时间对DC诱导去核率有重要影响，以hCG注射后17～18 h为最佳取卵时间；SrCl2在小鼠卵母细胞诱导去核中的总体作用效果略优于乙醇；乙醇激活后0min起始DC处理可得到最高的诱导去核率(63.4％)，在10 mM SrCl2中激活15 min后起始DC处理可得到最高的诱导去核率(63.9％)。
2.无透明带胚胎培养是无透明带手工核移植首先需要解决的问题。为了探索一种高效的无透明带胚胎培养方法，为手工核移植提供技术支持，本研究以ICR小鼠原核胚为材料，对比了现有的3种无透明带胚胎培养方法，对其中效果较好的WOW法进行改进，以海藻酸钙凝胶包埋小凹，并且尝试与共培养技术相结合。结果显示，海藻酸钙凝胶包埋小凹法(AEW法)的囊胚发育率(54.7％)和囊胚细胞平均数(54.3)显著高于微滴单卵培养法(MDS法)和琼脂柱包埋培养法(AE法)(p<0.05)，与WOW法相当(p>0.05)；使用AEW法进行培养时，最佳的海藻酸钠和钙离子浓度分别为0.7％和1.5％；该法与颗粒细胞共培养相结合后，胚胎卵裂率(89.7％)与囊胚发育率(67.9％)显著高于非共培养组(分别为79.5％和54.7％)(P<0.05)。实验结果表明，AEW法培养无透明带胚胎的效果优于其它几种方法；AEW法与颗粒细胞共培养相结合可以显著提高无透明带胚胎的胚胎卵裂率及囊胚发育率。
3.为了进一步简化哺乳动物体细胞核移植的操作程序，提高核移植的效率，加快其产业化的步伐，本研究以ICR小鼠卵母细胞为材料，将化学诱导去核技术和无透明带核移植技术相结合，初步建立了一套适合ICR小鼠的以化学去核卵母细胞为受体的无透明带体细胞核移植技术体系。结果显示，使用95V/mm电场强度，持续10μs的1次直流电脉冲诱导细胞融合的效果显著高于使用110 V/mm和125 V/mm电场强度诱发细胞融合的效果(p<0.05)；5 mM SrCl2处理1 h组的无透明带卵母细胞的激活率(82.9％)显著高于其它各组(p<0.05)，退化率(10.3％)显著低于其它各组(尸<0.05)，囊胚发育率(46.4％)略高于其它组，差异不显著(p>0.05)；无透明带体细胞核移植操作累积所用的时间(200 min)显著低于传统显微操作所用的时间(p<0.05)；无透明带体细胞核移植重构胚的重建率(83.3％)与传统显微操作核移植重构胚的重建率相当，差异不显著(P>0.05)；无透明带体细胞核移植得到的重构胚经激活处理后使用AEW法进行体外培养，其重构胚的类原核形成率、2-细胞率、4-细胞率和8-细胞率均略低于传统显微操作组，差异不显著(p>0.05)，没有重构胚发育到桑囊胚。结果表明，95 V/mm电场强度、持续10μs的1次直流电脉冲为无透明带卵母细胞-供体细胞复合体融合的最佳参数(可得到86.3％的融合率和6.84％的退化率)；以5 mM SrCl2对无透明带重构胚激活处理1h，可得到最佳激活效果(82.9％激活率，46.4％囊胚发育率)；本研究建立的ICR小鼠无透明带体细胞核移植技术体系简化了核移植程序，缩短了操作时间，提高了核移植的效率;体系中的各步骤还需进一步完善，以提高重构胚的囊胚发育率。