禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是引起禽大肠杆菌病重要的病原体,可引起多种禽类发病,形成局部或全身典型的感染症状、病变,给养殖业造成了巨大损失。APEC的抗原结构复杂多样,其中O抗原常作为APEC血清型分型依据,且以O1、O2、O78等优势致病血清型为主。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大肠杆菌细胞壁表面的主要组分,同时也是APEC致病的重要毒力因子,由脂质A、核心多糖和O抗原侧链等不连续的结构区域组成。LPS分子的合成和运输是细菌正常生存的必需条件。脂质A与致病力密切相关,是LPS分子中内毒素活性的基团。脂质A的结构完整性对于APEC的致病性具有重要作用,其合成过程中所涉及的毒力基因目前成为了国内外研究的热点。本研究以APEC优势血清型O1 E516株和O78 E522株为研究对象,针对脂质A合成过程中的两个后期酰基转移酶LpxL和LpxM,通过λ噬菌体Red同源重组技术分别构建了 APEC E516、E522 lpxL和lpxM基因缺失株及回补株,比较其与野生株的生物学特性,进一步分析了lpxL和lpxM基因对APEC毒力的影响,为深入研究APEC的致病机制奠定了基础。通过对APEC E516、E522株及其lpxL和lpxM基因缺失株、回补株进行生长特性、电镜观察、RT-PCR、HD-11吞噬和胞内存活能力及致病性的研究,分析菌株的生理生化特性及lpxL和lpxM基因对与不同血清型O1 E516和O78 E522株致病性的关系。生长曲线测定结果显示,各菌株在37℃的生长速度快于在42℃的生长速度,但在37℃和42℃,各菌株在基础培养基中的生长速度基本一致,在LB液体培养基中,E516ΔlpxL、E516ΔlpxL△lpxM、E522ΔlpxM、E522ΔlpxL△lpxM的生长速度明显慢于野生株。透射电镜结果显示,缺失株 E516ΔlpxL、E522ΔlpxM、E516ΔlpxLΔlpxM和 E522ΔlpxLΔlpxM与野生株相比,细胞外膜及表面结构层明显变薄,局部表面结构甚至不完整,回补株细胞表面结构稍有恢复,但并未完全恢复至野生株表面结构的完整性。RT-PCR结果显示,各缺失株中残留的缺失基因同源臂与氯霉素抗性基因去除时遗留的FLP重组酶(Flippase recombination enzyme,FLP)识别位点(FLP recognition target sites,FRT)临时组成新的转录本正常转录,产生了“意外转录子”。血清补体杀菌试验结果显示,在12.50%和 25.00%浓度的 SPF 鸡血清中,E516ΔlpxL、E516ΔlpxLΔlpxM、E522ΔlpxM、E522ΔlpxL△lpxM死亡率显著高于野生株(P<0.05),表明lpxL和lpxM基因有抗血清补体杀菌作用。1日龄SPF鸡半数致死剂量(LD50)测定结果显示,与野生株相比,缺失株的毒力降低1000倍左右,回补株的毒力未能完全恢复至野生株水平。21日龄SPF鸡体内定殖与持续试验结果显示,各缺失株在各脏器定殖的能力与野生株相比下降显著,回补株的定殖能力部分恢复,但也未完全恢复到野生株水平。HD-11细胞吞噬和存活试验结果显示,缺失株 E516ΔlpxL、E516△lpxLΔlpxM、E522ΔlpxM、E522ΔlpxLΔlpxM的抗吞噬能力和细胞内定殖存活能力较野生株显著下降,回补株ReE5 16ΔlpxL、ReE522ΔlpxM的存活能力有所提高,但亦未完全恢复至野生株水平。由此得出结论,lpxL和lpxM基因对于APEC O1 E516和O78 E522菌株的致病性和毒力具有重要影响,但有所差异。lpxL基因对O1 E516的影响程度大于lpxM基因,lpxM基因对O78 E522影响程度大于lpxL基因。