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目的:提取青蒿素后的药渣中富含青蒿素前体化合物青蒿酸等成分,运用现代分析化学,优化青蒿药渣中青蒿酸的提取和纯化工艺,通过体外细胞实验,探讨青蒿酸潜在的药效活性,为青蒿酸抗肿瘤活性提供研究基础和科学依据,使青蒿药渣得到更充分的利用,提升青蒿的综合利用价值。方法:1.采用反相HPLC法对青蒿药渣中的青蒿酸进行定量分析,分析条件为:乙腈:0.2%磷酸水=65:35,C18柱为固定相,流速为1mL/min,进样量为10μL,检测波长为220nm,柱温为25℃。2.采用超临界萃取青蒿素后的药渣作为本实验的原料,响应面实验设计优化提取青蒿素药渣中青蒿酸的提取工艺:采用乙醇超声提取法提取青蒿药渣中的青蒿酸,以青蒿酸得率为考察指标,在单因素试验的基础上,选取提取溶剂乙醇浓度、液料比、提取时间3个变量,进行Box-Behnken实验设计,采用溶剂法对提取后的青蒿酸进行初步纯化,硅胶柱层析法进一步进行纯化。3.采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测SMMC-7721细胞存活率,采用Hoechst-33258染色法检测细胞凋亡形态,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测SMMC-7721细胞凋亡率,从而考察青蒿酸体外抗肿瘤活性。结果:1建立了青蒿药渣中青蒿酸定量分析方法建立了青蒿药渣中青蒿酸含量测定的反相HPLC法,在0.209～2.09μg范围内回归方程为 Y=1029500X+6056.35904(R=0.9999),其平均回收率为 96.63%,RSD=1.26%(n=6)。2提取工艺青蒿药渣中青蒿酸的最佳提取工艺参数为91%的乙醇溶液为提取液、液料比为8.5、提取时间42min,在该条件下青蒿酸的提取率为0.458mg/g,所得青蒿酸的提取回归模型高度显著(R2=0.9859),拟合性好。3初步纯化工艺采用溶剂萃取法进行纯化。粗提浸膏混悬于水溶液,调节pH11,加入相同体积的石油醚洗涤两次,除去部分杂质。然后调节pH至5,按1:1的液料比例加入石油醚萃取两次,萃取液干燥,最后所得产品含量达5.724%。4硅胶柱层析纯化采用硅胶柱层析法对初步纯化的青蒿酸进一步分离纯化。石油醚洗脱至无色后,石油醚-乙酸乙酯(9:1)洗脱,得到的流份依次经乙酸乙酯、石油醚浓缩析出杂质,青蒿酸存在于母液中,回收溶剂后得青蒿酸,纯度为76.38%。5青蒿酸体外抗肿瘤活性青蒿酸作用于人肝细胞SMMC-7721细胞24h、48h、72h的半数抑制浓度(IC50)分别为 71.067μg/mL、35.800 μg/mL、13.308μg/mL,表明青蒿酸的确能抑制 SMMC-7721细胞的增殖。荧光显微镜下观察到青蒿酸作用48h后,SMMC-7721细胞形态不完整,染色质致密固缩集于核膜,出现凋亡小体等典型凋亡特征,提示凋亡机制在青蒿酸抗肝癌活性中有重要作用。进一步的流式细胞仪检测结果显示青蒿酸对细胞产生的诱导凋亡主要为晚期凋亡,随着给药浓度的增加,肝癌细胞凋亡比例明显上升,呈现良好的剂量依赖性,当浓度为75μg/mL时,调亡率高达67.54%。结论:1青蒿酸分析方法的建立优选了 HPLC的流动相及波长,建立的含量测定方法准确,简单,稳定性良好,适于青蒿酸的含量测定。2提取工艺通过Box-Behnken设计,得出青蒿酸的最佳提取工艺条件:液料比8.5:1,91%乙醇溶液在超声提取3次,每次42min,且验证结果较为接近,说明该提取工艺稳定,为后期的生产工艺研究奠定基础。3纯化工艺提取浸膏经溶剂萃取初步纯化后所得产品青蒿酸含量为5.724%;再经硅胶柱层析纯化后,纯度提高到76.38%。经过纯化,青蒿酸的含量由最初乙醇粗提的浸膏中0.4%左右提高到76.38%。4青蒿酸体外抗肿瘤活性青蒿酸可明显抑制人肝癌细胞SMMC-7721 24h、48h、72h的增殖,并呈现显著的时间、剂量依赖性。高浓度青蒿酸作用于人肝癌细胞SMMC-7721 48h后,细胞呈现出典型的细胞凋亡特征,凋亡率高达67.54%。进一步证实了凋亡机制在青蒿酸抗肝癌作用中发挥着重要作用。