神经氨酸酶(NA)是禽流感病毒的两种表面糖蛋白之一,属Ⅱ型糖蛋白,是一种糖苷外切酶,具有酶切活性。NA具有双重功能,一方面对于流感病毒本身而言,它可以裂解唾液酸和附近的糖残基之间的α-糖苷键,有利于子代病毒释放出来,并且在子代病毒从宿主细胞表面释放时能防止病毒聚集,促进病毒穿过覆盖在呼吸道上皮细胞的黏液而扩散;另一方面对于宿主细胞而言,由于宿主细胞膜上的神经氨酸(又名唾液酸,SA.)是流感病毒的主要受体,流感病毒与宿主细胞膜上SA受体结合后,才能进入细胞。而NA可以降解宿主细胞膜上的SA受体,抑制病毒进入细胞,使细胞免受AIV的感染。由于NA这一独特功能特点对防治AIV具有重要的意义,使其成为国内外抗禽流感病毒研究的热点之一,同时也为制备抗禽流感转基因家禽提供了新思路。本研究通过克隆NA基因,进行体内外表达、亚细胞定位及抗病毒活性检测,旨在探索将NA基因用于研制抗病转基因家禽的新思路。主要研究内容和结果如下:1.NA基因的克隆、序列分析及原核表达。设计合成NA基因特异性引物,以质粒pGEM-T-NA为模板,采用大引物PCR定点诱变技术将NA基因突变修正后克隆至pMD19-T Vector中,酶切与测序结果均表明pMD19-T-NA构建正确,且NA基因ORF正确无误。然后将NA基因定向克隆入载体pGEX-6P-1中,构建原核表达载体pGEX-NA;经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电脉分离,免疫印迹检测表明,重组NA蛋白获得了表达,且抗NA血清可识别表达产物。2.神经氨酸酶基因表达质粒免疫小鼠的研究。将NA基因定向克隆入pcDNA3.0载体中,构建表达载体pcDNA3.0-NA,采用不同免疫方式,分别以不同剂量的表达质粒免疫BALB/c小鼠;免疫后不同时间采集血液,分离收集血清;ELISA检测分析免疫效应。结果表明,所构建的表达质粒pcDNA3.0-NA免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体。3.体外重组神经氨酸酶的表达及其亚细胞定位研究。构建携带有EGFP报告基因融合表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA,并与pcDNA3.0-NA分别用PEI介导转染NIH-3T3细胞系。转染48 h后,前者直接在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞中的位置,后者先经间接免疫荧光检测,然后再在显微镜下观察荧光在细胞中的位置。两种方法结果一致,荧光集中分布在胞质近胞膜,细胞核内无荧光。通过荧光在细胞中的分布将重组NA蛋白表达定位在细胞膜上。4.神经氨酸酶抗病活性的研究。构建的真核表达载体pcDNA3.0-NA,用PEI介导转染NIH-3T3细胞,G418压力筛选获得阳性单克隆细胞系,经RT-PCR与Western Blot均可检测到NA基因的表达。然后收集并纯化细胞蛋白,采用NDV-CEF微量细胞抑制试验,来确定NA蛋白的抗病毒活性。重组表达NA蛋白对抗新城疫病毒感染结果显示,重组NA蛋白具有一定的抗新城疫病毒生物活性。