【背景】脑卒中已成为导致老年人死亡和残疾的最主要原因。前期大量流行病学调查和基础研究均证实雌激素具有显著的脑卒中神经保护作用。相比于同年龄段男性,绝经后女性脑卒中发病率明显增高且预后更差。但大规模临床试验却发现,雌激素替代疗法并未降低绝经女性脑卒中的发生率,甚至加剧了神经损伤,并增加了乳腺癌和子宫肌瘤的发病风险。因此,研究者回归基础实验,深入探究如何才能有效发挥雌激素的脑卒中神经保护作用及其机制,并提出了一系列假说,包括剂量依赖假说,关键期假说和受体选择性假说。前期研究发现,星形胶质细胞大量表达雌激素受体,是介导雌激素神经保护作用的重要靶点。ndrg2是我校生化教研室于2001年首先克隆的新基因,在脑内ndrg2特异性表达于星形胶质细胞,参与多种神经退行性疾病的发生发展,但其在脑缺血损伤中的作用还知之甚少。前期研究发现ndrg2是雌激素及其受体β的靶基因。然而,ndrg2在雌激素替代疗法防治脑卒中损伤中的作用还未见研究报道。【目的】1.探究雌激素替代疗法防治去卵巢动物脑缺血损伤的剂量选择效应和机制;2.探究雌激素替代疗法防治去卵巢动物脑缺血损伤是否存在治疗时间窗和机制;3.探究激活雌激素受体β(ERβ)能否减轻去卵巢动物脑缺血损伤及分子机制;4.探究ndrg2在雌激素替代疗法防治去卵巢动物脑缺血损伤的作用。【方法】1.在体:给予SD雌性大鼠、C57雌性小鼠和ndrg2基因敲除雌性小鼠去卵巢手术(OVX)构建雌性动物绝经模型,给予不同剂量的E2以及雌激素受体β激动剂DPN替代治疗,利用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)检测脑内ndrg2 mRNA表达情况,利用免疫印迹方法(Western blot)检测脑内GFAP、NDRG2表达情况;给予ndrg2Loxp小鼠侧脑室注射腺相关病毒,构建选择性下调成年雌鼠脑内ndrg2表达的工具鼠;对正常动物和接受激素替代治疗的OVX雌性动物构建大脑中动脉缺血(MCAO)和全脑缺血(GCI)模型,利用Garcia和Longa评分检测神经功能情况,利用RT-PCR检测ndrg2 mRNA表达情况,利用Western blot检测NDRG2、凋亡蛋白的表达,利用TTC染色、TUNEL染色、尼氏染色和Neun染色检测神经损伤情况;2.离体:利用PC12细胞系,原代培养的星形胶质细胞、神经元和二者共培养,给予不同剂量E2、ERα激动剂PPT和ERβ激动剂DPN处理,利用相差显微镜观察细胞形态改变,利用MTT法检测细胞活力,利用LDH测试检测细胞损伤,利用流式细胞仪检测细胞周期,利用细胞免疫荧光检测细胞增殖,利用Real Time PCR检测ndrg2 mRNA表达情况,利用Western blot检测GFAP、NDRG2表达情况;构建氧糖剥夺(OGD)模型,利用流式细胞仪检测神经细胞凋亡,利用RT-PCR检测ndrg2m RNA表达情况,利用Western blot和细胞免疫荧光检测NDRG2和凋亡蛋白表达情况。【结果】1.(1)生理剂量(10 nM或20 nM)的E2(E2)促进PC12细胞增殖,减轻OGD后PC12细胞的损伤,药理剂量(10μM或20μM)的E2抑制PC12细胞增殖,加重OGD后PC12细胞的损伤;(2)OVX显著增加了雌性大鼠脑缺血损伤,生理剂量(6μg/kg和20μg/kg)的E2替代治疗显著减轻OVX雌性大鼠脑缺血神经损伤,超生理剂量(50μg/kg)的E2替代治疗并没有减轻OVX雌性大鼠脑缺血神经损伤。2.(1)短期去卵巢(OVX 1w)和长期去卵巢(OVX 10w)并没有改变雌性小鼠脑内ERα的表达;(2)OVX 10w雌性小鼠脑内ERβ表达显著减少,ERα-Ser118位点磷酸化水平显著降低,而OVX 1 w雌性小鼠脑内ERβ表达无明显改变,ERα-Ser118位点磷酸化水平无明显改变;(3)生理低剂量(50μg/kg)或高剂量(100μg/kg)E2替代治疗能够显著减轻OVX 1w雌性小鼠脑缺血神经损伤,但不能减轻OVX 10w雌性小鼠脑缺血神经损伤。3.(1)在雌性小鼠脑内,ERβ主要与星形胶质细胞标志物GFAP存在共定位;在原代培养的星形胶质细胞,ERβ的表达明显多于ERα;(2)OVX雌性小鼠脑内GFAP表达显著下降,50μg/kg E2和8 mg/kg DPN替代治疗能够显著增加OVX小鼠脑内星形胶质细胞GFAP的表达;(3)(2.5 nM、5 nM、10 nM、20 nM)E2剂量依赖性上调原代星形胶质细胞GFAP的表达,并于5 nM和10 nM时达到峰值;10 nM DPN显著上调原代星形胶质细胞GFAP的表达,而10 nM PPT不能上调原代星形胶质细胞GFAP的表达;(4)50μg/kg E2和8 mg/kg DPN替代治疗能够显著减轻短期OVX雌性小鼠脑缺血神经损伤;(5)10 nM E2和10 nM DPN预处理星形胶质细胞能够减轻OGD后神经元凋亡;4.(1)E2能够上调原代星形胶质细胞ndrg2 mRNA和蛋白的表达,并存在时间和剂量依赖效应;(2)10 nM DPN上调原代星形胶质细胞ndrg2 mRNA和蛋白表达,10nM PPT不能上调原代星形胶质细胞ndrg2 mRNA和蛋白表达;(3)OVX雌性小鼠脑内ndrg2表达显著下降,50μg/kg E2、100μg/kg E2及8 mg/kg DPN替代治疗显著增加OVX雌性小鼠脑内ndrg2 mRNA和蛋白的表达,而2 mg/kg PPT替代治疗并不能显著增加OVX雌性小鼠脑内ndrg2 mRNA和蛋白的表达;(4)脑缺血损伤后,缺血半暗带区域ndrg2 mRNA和蛋白的表达于再灌注6 h开始增高,到24 h达到峰值,并发生核转位现象;(5)原代星形胶质细胞OGD损伤后ndrg2 mRNA和蛋白的表达于复氧复糖2 h显著增加,于6 h即达到峰值,并发生核转位现象;(6)ndrg2基因敲除(ndrg2-/-)雌鼠脑缺血神经损伤明显重于野生型(ndrg2+/+)雌鼠;利用腺相关病毒和ndrg2 Loxp雌性小鼠成功地选择性下调了成年雌性小鼠脑内NDRG2的表达,并加重了脑缺血神经损伤;(7)50μg/kg E2或8 mg/kg DPN替代治疗能够显著减轻ndrg2+/+-OVX雌鼠脑缺血神经损伤,而50μg/kg E2或8 mg/kg DPN替代治疗不能够减轻ndrg2-/--OVX雌鼠脑缺血神经损伤。【结论】1.应选择生理剂量的雌激素替代防治去卵巢动物的脑缺血损伤;2.雌激素替代疗法防治去卵巢雌性动物脑缺血损伤存在“最佳治疗时间窗”,与长期去卵巢动物脑内ERβ表达显著降低和ERα-Ser118位点磷酸化水平显著降低有关;3.选择性激活ERβ的DPN替代治疗(DRT)通过恢复去卵巢雌性动物脑内星形胶质细胞的活性减轻脑缺血神经损伤,加之其无致癌副作用,因此,选择性激活ERβ有望成为防治绝经女性脑卒中的新策略;4.星形胶质细胞ndrg2是雌激素及ERβ的靶基因;5.星形胶质细胞ndrg2是介导雌激素及ERβ脑缺血神经保护作用的关键分子。