研究背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,也是女性因癌症死亡的主要原因。在过去几十年中,乳腺癌的发病率在全球范围内一直处于迅速上升状态。尽管早期筛查的大规模普及和不断发展的综合治疗方法使得乳腺癌发病率和死亡率显著下降,但临床治疗仍然存在诸多挑战,例如化疗药物缺乏靶向破坏、严重的全身毒性作用和获得性多药耐药(MDR)的产生等,特别是目前尚未有针对三阴性乳腺癌的治疗性药物,该亚型乳腺癌较其它亚型乳腺癌预后仍然很差。因此,寻找一种安全有效、副作用小且靶向性强的治疗方法一直是临床医生和研究者们共同关注的问题。超声微泡(USMB)结合技术具有对靶向药物和局部特异性肿瘤药物进行安全、高效、高靶向性的输送等优势,在近十多年中得到迅速发展,其主要作用机制为USMB介导的声孔效应。声孔效应是指微气泡在超声波的作用下产生振荡,产生局部剪切应力或膨胀、塌陷,从而在细胞膜表面形成一些临时的孔隙,通过这些微孔将基因或药物转入靶细胞。这种USMB介导的声孔效应可以增加细胞膜的通透性,提高化疗药物的转染率,从而有效的提高肿瘤的疗效和减少化疗药物的毒副作用等。目前,大多数关于声孔效应的研究主要集中在USMB载药物或基因进入细胞内的转染以及微泡与细胞的相互作用方面,然而,在USMB介导的基因和药物转染过程中,不适当的USMB参数可能导致细胞损伤甚至细胞死亡以及转染效率降低,从而达不到理想的临床效果。因此,USMB参数的合理设置对提高声孔效应尤为重要。之前已有文献报道了微泡参数(包括微泡大小、造影剂浓度、外壳性质)和超声脉冲参数(包括脉冲重复频率、声强、辐照时间、脉冲波长和声峰负声压等)对声孔效应的影响,但这些研究多探讨的是单因素的改变引起的声孔效应的变化,缺乏USMB多参数多水平组合对声孔效应的影响的综合研究,此外,关于同一肿瘤组织来源的不同亚型细胞系对声孔效应的影响的研究相对较少,并且,对于肿瘤药敏细胞系及其耐药细胞系对声孔效应影响的对比研究报道较少。因此,对USMB参数进行定量差异分析,对于提高USMB介导的声孔效应有重要意义,也为以后的超声微泡联合化疗药物对不同的肿瘤组织进行标准量化的精准治疗提供线索。研究目的:1.对USMB的不同参数在不同的水平下进行组合优化研究,对比分析不同参数对同一组织来源的不同亚型细胞系的影响,观察不同细胞系的最佳USMB参数组合特征,进而在该最优USMB参数组合条件下,分析不同亚型细胞系的最大声孔效应,探讨同一组织来源的不同亚型肿瘤细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7)对声孔效应的影响;2.对USMB作用下耐药细胞系及药敏细胞系(MCF-7/ADR、MCF-7)的细胞膜通透性和细胞存活率进行研究,观察分析不同USMB参数对耐药细胞系及药敏细胞系的影响以及各细胞系的最优USMB参数组合,进而比较最优USMB参数组合模式下耐药细胞系和药敏细胞系的最大声孔效应,探讨USMB介导的声孔效应对耐药细胞系(MCF-7/ADR)逆转MDR的影响。实验方法:1.本研究首先选取3种乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7,选取微泡浓度、超声声强、辐照时间三个因素,分别选取3个因素的不同水平(微泡造影剂浓度:10%、20%、30%,超声声强:0.5 W/cm2、1.0 W/cm2、1.5 W/cm2,超声辐照时间:30s、60s、90s),设计L9(33)正交阵列实验方案。然后采用超声联合微泡按既定实验方案分别辐照3种细胞系,从而介导模型药物异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FD500)进行细胞内转运。以各细胞系的声孔效应及细胞存活率作为指标,记录实验结果。2.对上述L9(33)正交阵列实验结果进行极差分析。分别计算每个参数的第j列的第m水平的试验指标和(Kjm),以及每个参数的试验指标平均值(kjm),进行Kjm以及kjm的计算,判断出每个参数的优水平;同时计算极差R值(kmax-kmin),确定每种亚型乳腺癌细胞系的三个参数的影响主次,综合Kjm、kjm以及R值,最终得到每种乳腺癌细胞系的最优USMB参数组合。3.在最优USMB参数组合条件下,再次对3种不同亚型的乳腺癌细胞系进行超声联合微泡辐照介导FD500的细胞内转运,并记录实验结果。比较在采用最优USMB参数组合下,三种不同乳腺癌细胞系的最大声孔效应和细胞存活率,研究同一组织来源不同亚型的细胞系对USMB介导的声孔效应的影响。4.根据上述极差分析得到的R值,判断各参数对不同细胞系声孔效应及细胞存活率两个指标的影响程度(横向分析),进而得到各细胞系的不同参数影响水平排序;根据极差分析结果绘制细胞对不同影响因素的响应曲线图,观察各细胞系的声孔效应和细胞存活率随单一参数水平改变而发生的变化(纵向分析)。5.选用乳腺癌药敏细胞系MCF-7及其耐药细胞系MCF-7/ADR,分别选取3个变量的不同参数水平(微泡造影剂浓度:10%、20%、30%,超声声强:0.5 W/cm2、1.0 W/cm2、1.5 W/cm2,辐照时间:30s、60s、90s),设计 L9(33)正交阵列实验。按照正交试验试验方案,分别对上述两种细胞系进行USMB辐照,从而介导模型药物FD500进行细胞内转运。分别通过流式实验,分析两种细胞系的细胞膜通透性,得到两者的声孔效应,以及通过MTT实验,测得两种细胞系的细胞存活率,记录实验结果。6.根据上述L9(33)正交阵列实验结果,计算Kjm,kjm以及R值,分别得到耐药乳腺癌细胞系及药敏乳腺癌细胞系的最佳USMB参数组合,观察分析两种细胞系的最优USMB参数组合并比较其差异。在最优USMB组合条件下,再次对两种细胞系进行超声合微泡辐照介导FD500的细胞内转运。观察比较在最优USMB参数条件下耐药细胞系的最大声孔效应和细胞存活率,研究药敏乳腺癌细胞系及其耐药乳腺癌细胞系对USMB介导的声孔效应的影响。7.通过极差分析计算各参数组合的R值范围大小,判断各参数对耐药细胞系细胞膜通透性及细胞存活率两个指标的影响程度(横向分析);根据极差分析结果绘制细胞对不同影响因素的响应曲线,观察随着不同参数的水平改变,耐药细胞系及药敏细胞系的声孔效应和细胞存活率的变化,判断各参数对药敏细胞系和耐药细胞系的细胞存活率及声孔效应的影响。实验结果:1.不同乳腺癌细胞系的USMB参数优化通过对正交试验结果进行极差分析,我们得出K、k值及R值,通过对K、k值及R值的进一步计算和观察比较,进一步得到三组细胞系的最优USMB辐照参数组合,分别为MDA-MB-231:微泡浓度10%、超声强度1.5W/cm2、辐照时间90s;MDA-MB-468:微泡浓度20%、超声强度0.5W/cm2、辐照时间30s;MCF-7:微泡浓度30%、超声强度0.5W/cm2、辐照时间30s。2.最优USMB参数组合下,各细胞系的最大声孔效应和细胞存活率在最优USMB参数组合条件下,三组细胞系的最大声孔效应分别为:MDA-MB-231:46.70±5.79%、MDA-MB-468:53.44±5.69%、MCF-7:59.88±5.53%;细胞存活率分别为 MDA-MB-231:84.24±5.83%,MDA-MB-468:81.03±3.43%,MCF-7:80.48±3.22%。单因素方差分析与LSD-t检验结果显示,最优USMB参数组合下,任意两种细胞系之间的声孔效应差异具有统计学意义(P<0.05),细胞存活率差异则无统计学意义(P>0.05)。3.各参数水平对各细胞系的声孔效应及细胞存活率的影响根据正交试验试验中不同的参数组合对三种细胞系声孔效应和细胞存活率影响的极差R值,我们确定了3个影响因素(微泡浓度、声强、辐照时间)对声孔效应和细胞存活率的影响程度。将各个参数对每种细胞系声孔效应的影响程度进行排序,分别为:MDA-MB-231:微泡浓度>辐照时间>声强;MDA-MB-468:声强>辐照时间>微泡浓度;MCF-7:声强>微泡浓度>辐照时间。这些因素对细胞存活率的影响为MDA-MB-231和MCF-7:声强>辐照时间>微泡浓度;MDA-MB-468:微泡浓度>声强>辐照时间。通过细胞系对不同辐照参数的响应曲线可知,在设定范围内,随着微泡浓度的增加,MCF-7和MDA-MB-468细胞系的声孔效应逐渐增加,而MDA-MB-231细胞系的声孔效应开始时随着微泡浓度轻微增加,在微泡浓度较高(30%)时出现下降。另一方面,随着超声强度的增加,三种细胞系的声孔效应均增加。最后,随照射时间的延长,MDA-MB-468细胞系的声孔效应呈上升趋势,而MDA-MB-231细胞系的声孔效应则明显降低,MCF-7细胞系的声孔效应则呈先略上升后略下降而整体略上升趋势。三种细胞系的细胞存活率则随着微泡浓度、声强和辐照时间这三个因素增加均呈现不同程度的降低趋势。4.耐药乳腺癌细胞系及药敏乳腺癌细胞系的最优USMB参数组合通过对正交试验结果进行极差分析,我们得出耐药细胞系和药敏细胞系的K、k值及R值,通过对K、k值及R值的进一步计算和观察比较,最终得到两种细胞系的最优USMB参数组合:MCF-7:微泡浓度30%、超声强度0.5W/cm2、辐照时间30s;MCF-7/ADR:微泡浓度30%、超声强度1.0W/cm2、辐照时间60s。5.最优USMB参数组合下,耐药乳腺癌细胞系及药敏乳腺癌细胞系对FD500运载的影响在最优USMB参数组合下,MCF-7/ADR耐药细胞的最大声孔效应较MCF-7细胞系显著增加(65.39±4.01%vs 59.88±5.53%,P=0.026),两者差异有显著统计学意义;而两种细胞系经最优USMB参数组合辐照后,细胞存活率的差异无统计学意义(P>0.05)。6.对比分析USMB各参数对敏感及耐药MCF-7细胞系声孔效应及细胞存活率的影响在三个参数变量中,声强是对MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞系的声孔效应影响最大的因素。根据单因素响应曲线分析,我们可以看出两种细胞系的声孔效应在开始时随着声波强度的上升而增加,但当声强继续增加到1.5W/cm2时,耐药细胞系细胞膜的通透性反而下降。另一方面,随着微泡浓度的增加,两组细胞的声孔效应都逐渐增加。最后,MCF-7/ADR细胞的声孔效应随照射时间的延长而升高,而MCF-7细胞的通透性则无明显变化。可以看出对于MCF-7细胞来说,各个因素对声孔效应的影响程度为声强>微泡浓度>辐照时间;而对于MCF-7/ADR,声强>辐照时间>微泡浓度。同时,随着微泡浓度、声强和辐照时间这三个因素增加,两种细胞存活率总体呈下降趋势,同时,在微泡浓度为30%时,MCF/7的细胞存活率呈略上升趋势。实验结论:1.通过正交试验证实,不同亚型乳腺癌细胞系在USMB作用下的最优参数组合不同;并通过极差分析证明各参数在不同细胞系中对声孔效应和细胞存活率的影响作用不同。2.在各自最优的USMB参数组合条件下,同一组织来源的不同亚型细胞系的最大声孔效应不同,差异有统计学意义。3.乳腺癌药敏细胞系及乳腺癌耐药细胞系(MCF-7、MCF-7/ADR)达到最佳FD500转染率的最优USMB参数组合不同。4.在各自的最优USMB参数组合条件下,乳腺癌药敏细胞系及乳腺癌耐药细胞系(MCF-7、MCF-7/ADR)的最大声孔效应差异有统计学意义。且MCF/ADR细胞系的最大声孔效应明显高于MCF-7细胞系,这一结果对进一步探讨USMB联合抗癌药物逆转MDR提供更多的信息。5.三阴性乳腺癌亚型细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468)的最大声孔效应明显低于HER2过表达亚型细胞系(MCF-7)及耐药细胞系(MCF-7/ADR)。6.对于四种乳腺癌细胞系,不同的USMB参数对同一细胞系的声孔效应及细胞存活率的影响不同,同样,同一细胞系的声孔效应及细胞存活率随着同一参数水平变化,其响应程度不同。