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我国杨树天然林约300万公顷,人工林约700万公顷,柳树、悬铃木、樟树等园林绿化树种也分布几乎遍及全国,大量植源性污染如飞毛飞絮、果毛、紫黑色浆果等对环境产生了极大的污染,也对人体健康如皮肤过敏、鼻塞、流涕、咳嗽、甚至引发哮喘、过敏性鼻炎等造成严重的影响。减轻植源性飞毛飞絮污染的有效途径之一是利用基因工程手段来培育雄性不育、雌性不育或雌雄均不育的杨柳树、悬铃木、樟树等园林绿化树种新品种,其中雄性不育不能完全有效控制植源性污染,而雌性不育及雌雄均不育园林绿化树种因不产生花粉、种子或果实,即可有效控制植源性污染。梨雌蕊S-RNase基因在雌蕊中特异表达,其启动子为雌蕊特异表达启动子。为了解决上述飞毛飞絮污染问题,本研究对雌蕊特异表达S-RNase基因启动子进行克隆,并此基础上构建了雌性不育植物表达载体和雌雄不育植物表达载体,为培育雌性不育或雌雄均不育园林绿化树种提供了有用的分子工具。主要研究结果如下:
1、采用TAIL-PCR扩增梨S12-、S13-、S21-RNase基因5’端上游侧翼序列,长度分别为1448bp,854bp,1137bp,分别命名为PpS12pro(HM047239)、PpS13pro(HM047240)、PbS21pro(HM047241)。PLACE和PlantCARE对其进行顺式调控元件预测发现,三个5’端上游侧翼序列均具有典型TATA box和CAAT box,且上游均存在光应答调控元件(Box4,G-box)、脱落酸应答元件ABRE及水杨酸应答元件TCA-element等。根据砂梨S12-RNase基因5’端上游侧翼序列调控元件设计一系列5’端缺失片段,并连接到pBI101.2载体的SalⅠ与XbaⅠ酶切位点之间与GUS基因融合,成功构建了6个S12-RNase基因启动子植物表达载体PpS12pro-0-pBI101.2～PpS12pro-5-pBI101.2,Floral Dip法转化哥伦比亚野生型拟南芥,卡那霉素抗性平板筛选并PCR检测分别得到了4、48、17、19、10、19株阳性转基因植株及2、13、8、10、7、12株转基因纯合体植株,用于进一步验证该启动子的表达功能。
2、利用花椰菜品种‘绿岭’基因组DNA克隆了花药绒毡层特异BoA9基因启动子和类细胞毒素用途的半胱氨酸蛋白酶基因CysP1。以PpSlepro-pBI101.2为基础,在砂梨S12-RNase基因启动子下游XbaⅠ与XmaⅠ酶切位点之间插入半胱氨酸蛋白酶基因CysP1,构建了雌性不育植物表达载体PpS12pro-CysP1-pBI101.2；在此基础上,在PpS12pro-CysP1-pBI101.2上的ApaⅠ与ClaⅠ酶切位点之间反向插入BoA9pro-CysP1融合基因,成功构建了雌雄不育植物表达载体BoA9pro-CysP1-PpS12pro-CysP1-pBI101.2。雌性不育植物表达载体和雌雄不育植物表达载体分别可用于雌雄异株和雌雄同株的园林绿化树种的雌株的转基因改良,从而获得无果无籽的园林绿化树种的新品种,试图有效制止飞毛飞絮漫天飘飞现象。