【摘 要】
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端粒位于真核染色体的末端,并在维持基因组的稳定性和细胞活性方面发挥关键作用。端粒DNA由(TTAGGG)n重复序列构成,包括双链区和富含G的3’端悬垂单链区。(TTAGGG)n重复序列富含G
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端粒位于真核染色体的末端,并在维持基因组的稳定性和细胞活性方面发挥关键作用。端粒DNA由(TTAGGG)n重复序列构成,包括双链区和富含G的3’端悬垂单链区。(TTAGGG)n重复序列富含G的特性使端粒DNA极易受氧化损伤。由于端粒的特殊结构导致其DNA损伤修复的效率低于染色体上其他处DNA被修复的效率,所以在氧化应激过程中容易造成端粒DNA碱基氧化性损伤的积累。端粒DNA的氧化性损伤会影响到端粒的完整性和端粒长度的变化。因此,检测端粒中的氧化性损伤将在分子医学、早期诊断和化学品的遗传毒性鉴定方面提供巨大益处。8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤(8-oxo-7,8-dihydroguanine,8-oxoG损伤)是人类端粒DNA中最常见的氧化性损伤之一,它可以通过引起复制错误和干扰转录诱导遗传毒性。在这里,我们首次提出了能够检测和量化人类端粒氧化性损伤的超灵敏单分子成像技术。我们将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的末端延伸相结合,从而在氧化受损碱基的位置产生聚腺嘌呤(polyA)序列。所得到的polyA序列可以与偶联在磁珠上的富含T的信号探针杂交,形成具有完整的脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点的dsDNA。其可以启动核酸内切酶IV(Endo IV),从而切割信号探针,释放出AF488荧光团、polyA序列以及被切割后具有游离3′-OH末端的信号探针。具有游离3′-OH的信号探针可以在TdT的作用下产生偶联在磁珠上的长的polyA序列。释放的polyA序列和新产生的偶联在磁珠上的polyA序列都可以诱导Endo IV对信号探针进行切割,释放出更多的AF488荧光团。经过磁力分离后,上清液中的AF488荧光团可以被全内反射荧光(total internal reflection fluorescence,TIRF)单分子成像仪器检测到。该方法对8-oxoG损伤具有很高的灵敏度,检测限低至9.3×10-1717 M,并且可以识别0.001%的8-oxoG损伤。此外,该方法可灵敏地检测不同H2O2浓度所诱导的端粒内氧化性损伤8-oxoG水平的变化,并且对于经特定浓度1000μM H2O2处理的HeLa细胞提取的基因组DNA来说,该方法检测限低至0.078 ng。
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