目的:针对单克隆抗体存在的亲和力差、免疫原性强、非特异性及毒性等缺陷,本研究将研发可同时结合VEGFR2和EGFR且具有生物学活性的双特异性纳米抗体,以期为纳米抗体在肿瘤治疗方面提供新的研究方向。方法:大肠杆菌中表达目的蛋白;镍离子金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白;采用FACS法分析双特异性纳米抗体与肿瘤细胞表面抗原的结合情况;运用SPR技术定量检测纳米抗体分别与抗原EGFR和VEGFR2的结合情况;利用CCK-8试剂盒考察纳米抗体对细胞生长的抑制能力,用Graphpad Prism软件拟合曲线计算IC50值和EC50值;采用细胞划痕实验分析纳米抗体对细胞迁移能力的影响,并用Image-J软件灰度扫描计算细胞愈合率;免疫印迹法分析信号通路中磷酸化蛋白表达的情况,并用Image-J软件进行灰度扫描。结果:质粒在大肠杆菌中成功表达;经镍柱纯化得到目的蛋白,双特异性纳米抗体产量达到2 mg/L;纳米抗体可以与HT-29细胞中的抗原VEGFR2和EGFR结合;用SPR技术计算得到抗EGFR纳米抗体与抗原EGFR结合的K_D值为1.53E-8 M,抗VEGFR2纳米抗体与抗原VEGFR2结合的K_D值为2.138E-9 M,双特异性纳米抗体分别与抗原EGFR和抗原VEGFR2结合的K_D值为5.865E-7 M和6.666E-9 M;在CCK-8实验中,生长因子EGF刺激HT-29细胞的生长,EC50值为45.2 ng/m L,生长因子VEGF的EC50值为39.1 ng/m L,抗EGFR纳米抗体抑制HT-29细胞生长的IC50值为165.6 n M,抗VEGFR2纳米抗体的IC50值为514.9 n M,双特异性纳米抗体的IC50值为9.3 n M,而西妥昔单抗的IC50值为172.5 n M;在细胞划痕实验中,阴性对照组细胞愈合率为55.45%,抗EGFR纳米抗体组、抗VEGFR2纳米抗体组和双特异性纳米抗体组分别为14.42%、8.99%和6.84%;在免疫印迹法实验中,双特异性纳米抗体作用于细胞后,信号通路中磷酸化的蛋白呈剂量依赖性减少。结论:与单靶点纳米抗体相比,双特异性纳米抗体抑制肿瘤细胞生长作用更显著,表明Bi-Nb可以同时抑制不同信号通路,以增强对肿瘤细胞杀伤能力,为双特异性纳米抗体提供新的思路,使纳米抗体在恶性肿瘤的靶向治疗中显现出更广阔的应用前景。