【摘 要】
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该文利用Red重组技术将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到大肠杆菌基因组上,同时对大肠杆菌ptsG基因进行了敲除,以对大肠杆菌基因工程宿主菌进行改良,利于工程菌高密度发酵.首
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该文利用Red重组技术将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到大肠杆菌基因组上,同时对大肠杆菌ptsG基因进行了敲除,以对大肠杆菌基因工程宿主菌进行改良,利于工程菌高密度发酵.首先运用PCR技术,获得两翼与ptsG基因上下游同源,中间为氯霉素抗性基因和vgb基因的DNA片段,然后经电转化,将外源DNA片段导入Escherichia coli DH5α、JM109.在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区发生重组,vgb基因整合在ptsG基因的位置,同时基因ptsG被敲除,从而构建了变异菌株DH5αPV、JM109PV.在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αPV、JM109PV的最高菌密度和葡萄糖的利用率均明显高于各自的对照菌株DH5α、JM109,而且产酸量也低于对照菌株.这说明变异菌株具有良好的生长能力,且产酸量少,N-氨甲酰氨基酸水解酶在DH5αPV中获得了较高的表达,表明代谢工程改良菌株具有适用于工程菌高密度发酵的良好特性.通过离子交换层析和疏水层析纯化了短芽孢杆菌DY50的胞壁蛋白,并制备了抗体,效价在50000以上.构建了短芽孢杆菌DY50的噬菌体基因文库,试图从中分离其胞壁蛋白的强启动子及信号肽,为构建能分泌表达外源基因的表达元件奠定了基础.利用α-淀粉酶的强启动子在大肠杆菌DH5α中表达N-氨甲酰氨基酸水解酶.
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