【摘 要】
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目的:利用体内噬菌体展示技术筛选与人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞结合的小分子多肽并在体内外鉴定其结合特异性及靶向性。方法:1.将人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞接种于裸鼠体内,制备荷瘤裸鼠模型,用噬菌体展示随机环七肽库对荷瘤裸鼠进行3轮体内筛选。免疫组织化学法鉴定噬菌体在肿瘤组织及正常对照组织的分布情况,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测噬菌体克隆对NCI-H1299细胞的结合亲和力,鉴
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目的:利用体内噬菌体展示技术筛选与人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞结合的小分子多肽并在体内外鉴定其结合特异性及靶向性。方法:1.将人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞接种于裸鼠体内,制备荷瘤裸鼠模型,用噬菌体展示随机环七肽库对荷瘤裸鼠进行3轮体内筛选。免疫组织化学法鉴定噬菌体在肿瘤组织及正常对照组织的分布情况,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测噬菌体克隆对NCI-H1299细胞的结合亲和力,鉴定阳性单克隆噬菌体。2.提取阳性单克隆噬菌体DNA进行测序获得外源多肽的氨基酸序列,将重复率最高的序列合成靶向肽NSP1,并进行异硫氰酸荧光素（fluorescein,FITC）标记合成荧光探针FITC-NSP1。通过肽与噬菌体的竞争抑制实验鉴定所合成的靶向肽与NCI-H1299细胞的结合特异性。3.CCK8法检测荧光探针FITC-NSP1对NCI-H1299细胞增殖活性的影响;细胞划痕实验和Transwell实验检测荧光探针FITC-NSP1对NCI-H1299细胞迁移、侵袭的影响。4.通过细胞免疫荧光实验在倒置荧光显微镜下观察FITC-NSP1与细胞的结合情况鉴定FITC-NSP1对NCI-H1299细胞的结合特异性;流式细胞术检测FITC-NSP1对NCI-H1299细胞的结合特异性。5.通过小动物活体成像实验检测荧光探针FITC-NSP1在体内对肿瘤组织的靶向性,并检测荧光探针的最适浓度以及最佳成像时间。分离小鼠肿瘤组织及正常组织进行离体实验,进一步鉴定荧光探针的靶向性。结果:1.噬菌体肽库在荷瘤裸鼠体内经过三轮筛选,与NCI-H1299细胞特异性结合的噬菌体克隆得到富集。第3轮筛选后噬菌体在肿瘤组织的回收率是首轮的341.3倍,富集效果明显。2.免疫组织化学结果显示,肿瘤组织中富集的噬菌体随每一轮体内筛选的进行而增加,第3轮筛选后,与肿瘤组织结合的噬菌体明显多于正常组织。3.ELISA结果显示随机挑取的30个噬菌体克隆中有20个是阳性噬菌体克隆（亲和力>2.5）。4.阳性噬菌体克隆的测序结果显示序列CTNESIGTC重复率最高,且与数据库中已知氨基酸序列无相似性。将此序列合成靶向肽并命名为NSP1,同时进行FITC标记,合成靶向荧光探针FITC-NSP1和随机对照荧光探针FITC-sv NSP1。5.肽与噬菌体的竞争性抑制实验显示靶向肽NSP1可以和相应的阳性噬菌体克隆竞争结合NCI-H1299细胞。6.CCK8结果显示FITC-NSP1对NCI-H1299细胞增殖无明显影响;细胞划痕实验及Transwell实验结果显示FITC-NSP1在各检测时间段均不会对NCI-H1299细胞迁移、侵袭产生影响。7.细胞免疫荧光实验结果显示FITC-NSP1与NCI-H1299细胞结合的荧光强度为103.553±8.412,而随机对照荧光探针FITC-sv NSP1与NCI-H1299细胞结合的荧光强度为9.653±0.880,两者差异具有统计学意义（P<0.01）,此外FITC-NSP1不与其他癌细胞及正常细胞结合（P<0.01）,表明FITC-NSP1对NCI-H1299细胞具有特异性。8.流式细胞术结果显示FITC-NSP1标记NCI-H1299细胞的阳性百分比为70.54±2.15,明显高于其他细胞（P<0.01）,随机对照荧光探针FITC-sv NSP1标记的NCI-H1299细胞百分比为7.22±0.36,与FITC-NSP1相比差异具有统计学意义（P<0.001）。9.小动物活体成像结果显示FITC-NSP1在体内会逐渐累积在肿瘤部位,具有靶向性,且在4h时肿瘤组织的荧光强度达到最大,离体实验结果显示FITC-NSP1不会富集在其他正常组织。结论:本研究采用体内噬菌体展示技术筛选得到与NCI-H1299细胞特异结合的小肽NSP1,并在体内体外鉴定NSP1光学分子探针与肺癌细胞的结合特异性和靶向性,为非小细胞肺癌的早期诊断和靶向治疗的研究奠定了基础。
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