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缺血性脑损伤根本病理改变是神经元损害,是导致患者残死率高的核心原因之一[1]。而神经元损害除了细胞接受外源刺激导致蛋白表达和信号通路异常,细胞内源性转录产物表达改变也逐渐被发现是细胞损伤的关键因素[2]。近年来,研究发现双链RNA(double-stranded,ds RNA)可能是一种危险信号,通过细胞危险信号模式应答,引起细胞反应直至细胞凋亡[3]。但ds RNA是否作为一种内源性危险信号真正参与神经元损害,以及具体的调控机制尚不清楚,急需深入研究。因此,本实验的研究目标是探索ds RNA在缺血性脑损伤中的作用和调控机制。实验一OGD诱导HT22细胞产生B1 RNA形式的ds RNA目的:验证HT22细胞氧糖剥夺后产生内源性ds RNA,明确ds RNA的组成成分和序列。方法:1.培养建立HT22细胞的OGD(氧糖剥夺)模型,建立体外神经元细胞缺血性模型。光镜下观察细胞生长情况,神经元细胞成熟后OGD处理,光镜下观察细胞形态,检测LDH(乳酸脱氢酶)活性,评价损伤模型。2.免疫荧光标记ds RNA的表达。利用特异性结合ds RNA的J2抗体标记,DAPI染核,荧光显微镜下观察Merge图像。3.建立ds RNA的c DNA文库,与小鼠B1 RNA序列比对。通过IP,q RT-PCR,反转录PCR,T-A克隆,琼脂糖核酸凝胶电泳实验,测序分析。结果:1.光镜下观察OGD 6小时后的HT22,细胞核膜形态发生变化,细胞缩小,细胞体肿胀,核固缩,空泡样疏松化,粗面内质网囊泡和线粒体肿胀。细胞损伤加剧。HT22细胞在OGD处理后与对照组相比较,LDH活性明显升高。OGD模型建立成功。2.荧光显微镜下清晰可见与J2抗体结合的ds RNA,在OGD 24小时组较之空白对照组明显增加,主要分布在核周胞质内。3.测序分析发现,OGD后产生的ds RNA与小鼠B1 RNA序列是相似的,而OGD后产生的ds RNA主要是215bp的B1 RNA。与小鼠的B1以及B1 DNA序列是一致的。琼脂糖核酸凝胶电泳实验和q RT-PCR实验中ds RNA的主要成分为B1 RNA。结论:HT22细胞在OGD处理后,细胞内产生的ds RNA的主要组成为B1 RNA,其与小鼠B1序列一致。实验二B1 RNA和NLRP3在OGD作用以及MCAO模型小鼠原代神经元细胞中的表达目的:离体小鼠大脑皮层神经元OGD模型和在体小鼠MCAO(小鼠大脑中动脉栓塞)模型中确认B1 RNA的产生以及NLRP3炎性通路的激活。方法:1.小鼠原代神经元OGD模型和小鼠MCAO模型建立。光镜下观察OGD后神经元的形态,LDH活性测定,小鼠神经功能评分,TTC染色。2.q RT-PCR检测小鼠-神经元细胞B1 RNA和NLRP3的表达。Western blot检测NLRP3的表达。pc DNA3.1-B1转染小鼠大脑皮层原代神经元细胞,通过MTS实验,q RT-PCR,Western blot实验分别检测B1 RNA转录和NLRP3的表达。结果:1.与正常的原代神经元对比,OGD作用2h后可见神经元细胞损伤,轴突变短甚至消失。神经元细胞在OGD处理后与对照组相比较,LDH活性明显升高。神经功能评分显示MCAO小鼠神经功能异常,TTC染色显示MCAO小鼠大脑出现苍白色缺血区域,模型建立成功。2.免疫荧光显示MCAO小鼠神经元细胞中ds RNA和NLRP3表达显著。q RT-PCR和Western blot结果显示小鼠MCAO后B1和NLRP3表达升高。OGD组和pc DNA3.1-B1实验组,NLRP3蛋白表达量显著高于对照组。而pc DNA3.1-B1+si NLRP3实验组,NLRP3的蛋白表达量显著低于pc DNA3.1-B1实验组。同时,OGD+si NLRP3实验组,NLRP3的蛋白表达量显著低于OGD组。该结果提示,在我们的实验中成功干涉了OGD以及B1 RNA诱导的NLRP3表达。MTS实验显示OGD作用以及转染pc DNA3.1-B1,可显著抑制小鼠原代神经元细胞的生长,。干涉OGD和pc DNA3.1-B1组小鼠原代神经元细胞中NLRP3的表达可改善细胞的生长活性。结论:OGD模型以及小鼠MCAO模型中,小鼠大脑皮层原代神经元细胞B1 RNA和NLRP3在表达上调。B1RNA和NLRP3的增多可抑制小鼠大脑皮层原代神经元细胞的生长。实验三B1 RNA以及NLRP3通路调控的炎性因子在OGD模型HT22细胞中的表达及关系目的:研究B1与NLRP3通路调控的炎性因子在缺血性脑损伤中的表达。方法:通过Western blot,q RT-PCR,ELISA等实验检测OGD作用、转染pc DNA3.1-B1和pc DNA3.1-B1+si NLRP3后,HT22细胞中NLRP3,IL-1β,TNF-α的表达量。MTS实验和ELISA实验同样用来检测转染pc DNA3.1-B1质粒和pc DNA3.1-B1+si NLRP3后的细胞活性以及各种促炎因子的表达。结果:Western blot显示NLRP3表达量随OGD时间延长而增加;q RT-PCR显示OGD后HT22细胞中的NLRP3通路被活化;ELISA显示HT22细胞OGD后从12小时开始IL-1β和TNF-α的表达量开始升高。转染B1后的HT22细胞NLRP3表达升高。转染pc DNA3.1-B1的HT22细胞中NLRP3、IL-1β和TNF-α三个炎性因子的表达较对照组和空质粒组升高。ELISA结果显示:转染pc DNA3.1-B1的HT22细胞中IL-1β和TNF-α的表达较对照组和空质粒组升高。MTS实验显示:OGD组细胞生长比对照组活性降低,pc DNA3.1-B1组较空质粒组和对照组活性降低,而OGD+si NLRP3组较OGD组细胞活性升高,pc DNA3.1-B1+si NLRP3组较pc DNA3.1-B1组活性升高。结论:B1 RNA参与介导OGD诱导HT22细胞中NLRP3活化上调IL-1β和TNF-α炎性因子,促进细胞损伤过程。