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背景:
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是血液系统的一种恶性肿瘤，这种疾病的特点是造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC)的功能出现障碍，在骨髓中聚集大量髓系祖细胞(Myeloid progenitor)。目前对AML发病机制及治疗方法的研究都取得了很大进展，然而原发耐药和复发难治仍然是提高AML患者预后的瓶颈。近年来很多学者认为骨髓微环境(Microenvironment)在AML的发生发展中起到了至关重要的作用，有关骨髓微环境和AML细胞之间相互作用的研究进行的如火如荼。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)在骨髓微环境中的作用尤其受到关注。正常生理状态下，MSC参与调节HSC的功能，维持正常的造血过程，而在AML的骨髓微环境中，MSC发生了变化，改变后的MSC会抑制正常的造血过程，支持AML细胞的存活和增殖。因此我们认为探讨AML相关MSC的变化有助于提高AML的治疗效果。之前有研究报道AML细胞中的自噬水平高于正常的骨髓单个核细胞，抑制自噬可以明显提高AML细胞的化疗敏感性。但是自噬在AML患者骨髓来源的MSC中是否也有所提高及其对白血病的发生发展是否产生影响尚未可知。
目的:
本研究主要探讨了AML-MSC中的自噬水平对其特征的影响，以及AML-MSC中的自噬水平对白血病细胞凋亡、增殖、耐药的影响，并进行了初步的机制探究。
方法:
在线分析软件DAVID用于健康供者来源的MSC(HD-MSC)和AML患者来源的MSC(AML-MSC)转录组芯片差异基因的富集分析;基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)用于分析潜在的富集信号通路;实时定量PCR用于检测富集到的信号通路中关键基因的表达水平;免疫印迹法用于检测MSC中的自噬水平;3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和慢病毒载体shATG5用于下调AML-MSC中的自噬水平;流式细胞术用于检测细胞凋亡、细胞周期及MSC表面标志物;油红O染色用于检测MSC的成脂分化能力;茜素红染色用于检测MSC的成骨分化能力;实时定量PCR用于检测成脂及成骨标志基因的表达情况;噻唑蓝(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)比色法用于检测细胞活性;免疫印迹法用于探究可能涉及到的信号通路;GraphPad用于计算IC50及统计分析，p＜0.05被认为具有统计学差异。
结果:
(一)AML-MSC和HD-MSC的转录组芯片具有明显差异;差异基因富集分析结果显示AML-MSC中共有12条信号通路上调，其中溶酶体信号通路的上调最显著，38条信号通路下调，其中细胞周期下调最显著;GSEA富集分析结果与KEGG富集分析结果一致，提示溶酶体等信号通路相关基因在AML-MSC中富集，而细胞周期等通路相关基因在HD-MSC中富集。
(二)实时定量PCR结果提示，AML-MSC中溶酶体信号通路关键基因NPC2(p=0.0428)和LAMP2(p=0.0439)均有所上调;溶酶体参与调控的自噬在AML-MSC中被异常激活，实时定量PCR结果显示ATG5(p=0.0086)表达上调，westernblotting结果显示AML-MSC中LC3βⅡ(p=0.044)及ATG5(p=0.017)蛋白水平上调，p62(p=0.036)蛋白水平有所降低。
(三)在AML-MSC中用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)或者沉默ATG5基因的表达后均可以抑制AML-MSC中的自噬水平;抑制自噬后AML-MSC的细胞凋亡未受到影响;抑制自噬后AML-MSC中G0/G1期细胞增多，G2/M期细胞减少;抑制自噬后AML-MSC的成骨分化及成脂分化能力降低。
(四)抑制自噬后AML-MSC中CXCL12的表达降低;将AML细胞系THP1和NB4分别与抑制自噬前后的AML-MSC共培养，结果显示实验组与对照组相比THP1和NB4细胞凋亡情况及细胞周期分布均未发生改变;与对照组相比，抑制自噬后的AML-MSC与AML细胞系共培养后，AML细胞对化疗药物柔红霉素(daunorubicin，DNR)和阿霉素(doxorubicin，DOX)的敏感性提高，并且呈时间依赖性和剂量依赖性;与对照组相比，相同浓度的DNR和DOX在与抑制自噬的AML-MSC共培养后的AML细胞中诱导的细胞凋亡比例明显上升。
(五)Westernblotting结果显示，与对照组相比，THP1和NB4分别与抑制自噬的AML-MSC共培养后，磷酸化的ERK1/2及磷酸化的AKT表达均降低。
结论:
AML-MSC中的自噬被异常激活。自噬影响AML-MSC的细胞周期及分化能力。抑制自噬后的AML-MSC对AML细胞系的支持作用减弱，表现为与抑制自噬后的AML-MSC共培养后，白血病细胞系对化疗药物的敏感性显著提高，其中的机制可能是由于抑制自噬以后，AML-MSC表达的CXCL12显著降低，进而影响到AML细胞系中ERK1/2和AKT的活性。我们的研究证明了以AML-MSC中的自噬或者ATG5为靶点，可以提高AML对化疗药物的敏感性。这对于提高AML患者尤其是一些原发耐药和复发难治型患者的治疗效果具有重要的意义。
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是血液系统的一种恶性肿瘤，这种疾病的特点是造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC)的功能出现障碍，在骨髓中聚集大量髓系祖细胞(Myeloid progenitor)。目前对AML发病机制及治疗方法的研究都取得了很大进展，然而原发耐药和复发难治仍然是提高AML患者预后的瓶颈。近年来很多学者认为骨髓微环境(Microenvironment)在AML的发生发展中起到了至关重要的作用，有关骨髓微环境和AML细胞之间相互作用的研究进行的如火如荼。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)在骨髓微环境中的作用尤其受到关注。正常生理状态下，MSC参与调节HSC的功能，维持正常的造血过程，而在AML的骨髓微环境中，MSC发生了变化，改变后的MSC会抑制正常的造血过程，支持AML细胞的存活和增殖。因此我们认为探讨AML相关MSC的变化有助于提高AML的治疗效果。之前有研究报道AML细胞中的自噬水平高于正常的骨髓单个核细胞，抑制自噬可以明显提高AML细胞的化疗敏感性。但是自噬在AML患者骨髓来源的MSC中是否也有所提高及其对白血病的发生发展是否产生影响尚未可知。
目的:
本研究主要探讨了AML-MSC中的自噬水平对其特征的影响，以及AML-MSC中的自噬水平对白血病细胞凋亡、增殖、耐药的影响，并进行了初步的机制探究。
方法:
在线分析软件DAVID用于健康供者来源的MSC(HD-MSC)和AML患者来源的MSC(AML-MSC)转录组芯片差异基因的富集分析;基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)用于分析潜在的富集信号通路;实时定量PCR用于检测富集到的信号通路中关键基因的表达水平;免疫印迹法用于检测MSC中的自噬水平;3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和慢病毒载体shATG5用于下调AML-MSC中的自噬水平;流式细胞术用于检测细胞凋亡、细胞周期及MSC表面标志物;油红O染色用于检测MSC的成脂分化能力;茜素红染色用于检测MSC的成骨分化能力;实时定量PCR用于检测成脂及成骨标志基因的表达情况;噻唑蓝(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)比色法用于检测细胞活性;免疫印迹法用于探究可能涉及到的信号通路;GraphPad用于计算IC50及统计分析，p＜0.05被认为具有统计学差异。
结果:
(一)AML-MSC和HD-MSC的转录组芯片具有明显差异;差异基因富集分析结果显示AML-MSC中共有12条信号通路上调，其中溶酶体信号通路的上调最显著，38条信号通路下调，其中细胞周期下调最显著;GSEA富集分析结果与KEGG富集分析结果一致，提示溶酶体等信号通路相关基因在AML-MSC中富集，而细胞周期等通路相关基因在HD-MSC中富集。
(二)实时定量PCR结果提示，AML-MSC中溶酶体信号通路关键基因NPC2(p=0.0428)和LAMP2(p=0.0439)均有所上调;溶酶体参与调控的自噬在AML-MSC中被异常激活，实时定量PCR结果显示ATG5(p=0.0086)表达上调，westernblotting结果显示AML-MSC中LC3βⅡ(p=0.044)及ATG5(p=0.017)蛋白水平上调，p62(p=0.036)蛋白水平有所降低。
(三)在AML-MSC中用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)或者沉默ATG5基因的表达后均可以抑制AML-MSC中的自噬水平;抑制自噬后AML-MSC的细胞凋亡未受到影响;抑制自噬后AML-MSC中G0/G1期细胞增多，G2/M期细胞减少;抑制自噬后AML-MSC的成骨分化及成脂分化能力降低。
(四)抑制自噬后AML-MSC中CXCL12的表达降低;将AML细胞系THP1和NB4分别与抑制自噬前后的AML-MSC共培养，结果显示实验组与对照组相比THP1和NB4细胞凋亡情况及细胞周期分布均未发生改变;与对照组相比，抑制自噬后的AML-MSC与AML细胞系共培养后，AML细胞对化疗药物柔红霉素(daunorubicin，DNR)和阿霉素(doxorubicin，DOX)的敏感性提高，并且呈时间依赖性和剂量依赖性;与对照组相比，相同浓度的DNR和DOX在与抑制自噬的AML-MSC共培养后的AML细胞中诱导的细胞凋亡比例明显上升。
(五)Westernblotting结果显示，与对照组相比，THP1和NB4分别与抑制自噬的AML-MSC共培养后，磷酸化的ERK1/2及磷酸化的AKT表达均降低。
结论:
AML-MSC中的自噬被异常激活。自噬影响AML-MSC的细胞周期及分化能力。抑制自噬后的AML-MSC对AML细胞系的支持作用减弱，表现为与抑制自噬后的AML-MSC共培养后，白血病细胞系对化疗药物的敏感性显著提高，其中的机制可能是由于抑制自噬以后，AML-MSC表达的CXCL12显著降低，进而影响到AML细胞系中ERK1/2和AKT的活性。我们的研究证明了以AML-MSC中的自噬或者ATG5为靶点，可以提高AML对化疗药物的敏感性。这对于提高AML患者尤其是一些原发耐药和复发难治型患者的治疗效果具有重要的意义。