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L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, L-Phe)是人体的一种必需氨基酸,对人体具有重要的作用。目前,由于甜味剂阿斯巴甜(aspartame, AMP)、氨基酸类抗癌药物及营养保健品的生产和应用,使L-Phe的市场需求量大大增加。但是国内仅有的几个L-Phe的生产企业,规模都比较小,产酸率也只有8%左右,靠国内生产的L-Phe不能满足市场需求,所以国内应用的L-Phe主要靠进口。为促进以L-苯丙氨酸为原料的产业的发展和降低我国的经济负担,大力开发和完善L-苯丙氨酸的发酵生产技术和工艺,实现规模化工业生产,是十分有必要的。目的1.以大肠杆菌MG1655为宿主菌,将含有相同质粒的营养缺陷型菌株在分别以甘油、葡萄糖、甘油和葡萄糖的混合物为碳源的培养基中进行发酵,比较不同碳源对细菌生长及L-Phe产量的影响。2.将不同质粒分别在野生型菌株和营养缺陷型菌株中表达,并在同等条件下进行发酵。在发酵结束时,比较不同质粒在两种菌株中的生长情况和L-Phe的产量差别,筛检出高产菌株。方法1.采用λ-Red重组的方法将野生型MG1655染色体上的pheL、pheA、tyr A和aroF四个基因敲除,获得营养缺陷型菌株MG1655△aroF。2.通过定点突变和multiplex PCR等技术,以pZE12为载体构建不同的基因型质粒。3.将基因重组和野生型菌株分别在以甘油、葡萄糖、甘油和葡萄糖混合液(甘油和葡萄糖以质量比3：2的比例混合)为碳源的培养基中培养。用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发酵过程中分别由pheA、aroF和aroG编码的蛋白酶的表达情况。将蛋白酶高表达的菌株进行发酵。4.发酵过程中,用薄板层析法粗测L-Phe的产量；发酵结束后,用氨基酸自动分析仪测定发酵液中游离L-Phe的含量。结果1.同一基因型大肠杆菌分别在以葡萄糖、甘油、甘油与葡萄糖混合物为碳源的培养基中发酵。结果显示细菌在葡萄糖中生长最慢,在混合培养基中进入对数期较晚,L-Phe在甘油中的产量高于在葡萄糖和混合碳源中的产量,最高可达两倍。2.将本实验中所构建的6个基因型分别在营养缺陷型大肠杆菌菌株和野生型菌株中表达,并在甘油中发酵。结果显示在pheA和aroG串联表达的基因型中,pZE12pheAfbraroGM(pZE12AfbrGM)合成L-Phe的能力最强,而pZE12pheAaroG (pZE12AG)的最弱；在pheA和aroF串联表达的基因型中,pZE12pheAfbraroF (pZE12AfbrF)合成L-Phe的能力大于pZE12pheAaroF (pZE12AF)。同一个基因型质粒在MG1655中的生长速度比在MG1655△aroF中快,但是在MG1655中的L-Phe产量低于MG1655△aroF。结论1. pZE12AFMG△aroF、pZE12AfbrFMG△aroF、pZE12AGMG△aroF、pZE12AGMMG△aroF、pZE12AfbrGMG△aroF和pZE12AfbrGMMG△aroF在甘油中的生长趋势和合成L-Phe的能力均比在葡萄糖中的好。2.pheA和aroG的抗反馈抑制体,可以增强大肠杆菌合成L-Phe的能力。3.MG1655有利于细菌的生长,但是合成L-Phe的能力比MG1655△aroF低。