【摘 要】
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白细胞介素17（interleukin 17,IL-17）家族与炎症和感染存在紧密联系,但目前国内外对IL-17B和IL-17E作用机制尚未研究清楚,而且只有人和小鼠的IL-17家族的基因序列被全部克隆出来,而猪的IL-17家族基因序列则尚未被完全克隆,因此本研究可以弥补猪的IL-17家族研究的空白,可望为治疗畜牧业炎性肠病提供理论依据。本研究以人IL-17B基因核酸序列为模板,与猪EST库进行比
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白细胞介素17（interleukin 17,IL-17）家族与炎症和感染存在紧密联系,但目前国内外对IL-17B和IL-17E作用机制尚未研究清楚,而且只有人和小鼠的IL-17家族的基因序列被全部克隆出来,而猪的IL-17家族基因序列则尚未被完全克隆,因此本研究可以弥补猪的IL-17家族研究的空白,可望为治疗畜牧业炎性肠病提供理论依据。本研究以人IL-17B基因核酸序列为模板,与猪EST库进行比对,将得到的序列进行拼接,预测到猪IL-17B基因序列,设计引物并以猪小肠组织总RNA经逆转录得到的c DNA为模板,克隆得到猪IL-17B基因序列。将其他哺乳类动物以及NCBI上公布的猪IL-17E预测序列进行同源比对,设计简并引物并以猪小肠组织总RNA经逆转录得到的c DNA为模板,克隆得到猪IL-17E基因序列。然后对猪IL-17B和IL-17E进行生物信息学分析。成功构建了IL-17B和IL-17E原核表达载体并转入Rosetta表达菌株进行表达,经Ni亲和层析柱纯化得到的包涵体蛋白浓度约为1.3μg/μL。将包涵体蛋白溶解透析后免疫BALB/c小鼠,得到效价分别为102400和204800的小鼠抗重组猪IL-17B抗体和IL-17E抗体。成功构建IL-17B和IL-17E真核表达载体,并转染IPEC-J2细胞。经RT-q PCR检测转染后IPEC-J2细胞中IL-17B和IL-17E表达分别提高2791289倍和15068161倍,经ELISA检测上清液中IL-17E蛋白浓度约为2.75 ng/μL。经过RT-q PCR检测,IL-17B过表达后IL-1β、IL-8表达上调,推测其主要发挥促炎作用,而IL-17E过表达后IL-10表达上调,推测其主要与抑制炎症有关,此外IL-17B与IL-17E都能提高抗菌肽PR-39、p BD-1的表达,证明了IL-17B与IL-17E的抗感染作用。通过单菌刺激和双菌刺激IPEC-J2细胞,发现部分病原菌可以上调IL-17B或IL-17E表达水平,当加入益生菌后IL-17B或IL-17E表达水平降低,证实病原菌感染后加入益生菌具有下调细胞因子的作用。与病原菌单菌刺激时相比,加入益生菌后IL-17B和IL-17E都为下调,说明IL-17B和IL-17E均参与了益生菌的肠道免疫功能,但其功能还需进一步研究。
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