研究背景和目的异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)是目前治疗血液系统恶性疾病的有效手段之一。移植后约50-70%受者会发生移植物抗宿主病(GVHD),其中近半数患者因GVHD及GVHD相关并发症而致死,成为当前制约allo-HSCT疗效的最主要因素。GVHD发生是一个极为复杂的病理生理过程,关于其发生机理尚不十分明确,目前认为主要是由于供受者主要组织相容性抗原(MHC)的不同激活供者的T细胞,发生Th1、Th2细胞的分化不平衡和细胞因子级联反应,最终导致急慢性GVHD。急性GVHD (aGVHD)发生概括起来可分为三个阶段,第一阶段：大剂量的放化疗引起宿主的组织损伤,包括肿瘤坏死因子α (TNFa)和白介素-1(IL-1)等前炎性因子释放产生的级联放大效应,激活了宿主的抗原提呈细胞(APC)；第二阶段：供者T细胞识别宿主APC上的异体抗原而被激活并大量增殖,分化为效应细胞,分泌细胞因子,特别是TNFa,干扰素γ (IFNy);第三阶段：效应细胞产生的细胞毒作用和]NFa导致靶细胞的凋亡。在移植受者体内主要由同种异体反应性T细胞介导GVHD,该群细胞同时也介导着移植物抗白血病／淋巴瘤(GVL)效应,在预防白血病等肿瘤复发中发挥着重要作用。树突状细胞(DC)和其他APC介导同种异体反应性T细胞活化和分化。次级淋巴器官如肠系膜淋巴结(MLN)是受者APC与供者T细胞间相互作用的主要场所。放化疗后前炎性细胞因子IFNy等水平升高,促进受者组织内DC上调表达CCR7,同时淋巴结内CCR7配体CCL19, CCL21表达水平亦升高,介导DC从组织迁移至引流淋巴结,诱导供者T细胞表达组织特异性归巢与趋化因子受体。在MLN中,供者T细胞主要与受者CD103+DC作用,上调表达胃肠道特异性归巢受体,如α4β7, CCR9。在外周淋巴结(PLN)中,供者T细胞与受者DC作用后上调表达皮肤归巢受体,如E-配体,P-配体,CCL4, CCL10。活化的供者T细胞继而迁移至上皮组织如肠道、皮肤,导致GVHD损伤。本课题组前期研究表明在移植前应用Fc受体结合(FB)型CD3单抗+全身照射(TBI)预处理能使MLN和PLN中供者T细胞下调表达胃肠道和皮肤归巢趋化因子受体,有效减少供者T细胞迁移至肠道、皮肤等GVHD靶器官中,从而减轻GVHD损伤,而大部分供者T细胞存留于恶性白血病或淋巴瘤细胞残留的淋巴造血组织中,识别杀伤肿瘤细胞,介导GVL效应。这表明移植前FB型CD3单抗治疗可以有效预防GVHD保留GVL效应。进一步研究发现在MLN中CD103+DC包括CCR7+DC和CCR7-DC亚群,而在PLN中所有的DC均为CD103,但也包括CCR7+DC和CCR7-DC亚群。体内外实验证实在这两个亚群中仅CCR7+DC可诱导供者T细胞表达归巢趋化因子受体。此外,前期研究也表明FB型CD3单抗能特异性清除淋巴结中的CCR7+DC。因此我们推测FB型CD3单抗预处理预防GVHD发生及GVL效应的保留与CCR7+DC清除相关,但CCR7+DC清除机制及CCR7+DC在GVHD中的作用尚不清楚。文献报道在啮齿类动物和人体内,FB型CD3单抗治疗后可引起T细胞活化,释放白介素-2(IL-2), TNFα, IFNγ,白介素-6(IL-6),引起“细胞因子风暴综合症”。非Fc受体结合(FNB)型CD3IgG3具有与FB型CD3单抗(克隆145-2C11)相同的可变区,其差别在于恒变区被鼠IgG3代替,不具有Fc受体(FcR)结合能力,FNB型CD3IgG3治疗后几乎不引起T细胞活化,仅释放少量的IL-2, TNFα,可避免产生“细胞因子风暴综合症”。本课题组研究已发现FNB型CD3IgG3的确可减轻“细胞因子风暴综合症”,但FNB型CD3IgG3只能部分清除CCR7+DC,且不能有效预防GVHD。这提示FB型CD3单抗处理后释放的细胞因子及FcR的结合能力可能与CCR7+DC缺失及GVHD预防有效性有关。因此本研究拟采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL检测)及流式细胞学技术检测CCR7+DC凋亡状态,并从以下三方面研究FB型CD3单抗清除CCR7+DC的可能机制：1)基于研究表明IFNy可上调Fas表达,我们推测CCR7+DC的清除可能与FB型CD3单抗治疗后其表面Fas表达上调,继而诱导CCR7+DC凋亡有关。2) TNFα可介导各种细胞凋亡,且是FB型CD3单抗治疗后释放的主要细胞因子之一,故本研究拟从TNFα细胞因子角度出发,应用FB型CD3单抗对TNFα-/-小鼠进行处理,以观察TNFα水平升高是否在CCR7+DC清除中发挥作用。3)基于FB型和FNB型CD3单抗对CCR7+DC清除效果不一,我们应用FB型CD3单抗分别对野生型和FcR-/-小鼠进行预处理,以探讨FcR结合能力在CCR7+DC清除中的作用。因前期研究结果表明CCR7+DC缺失与GVHD预防效果呈正相关性,为进一步明确受者CCR7+DC在aGVHD中的作用,我们拟以CCR7-/-小鼠作为受鼠,使用或不用FB型CD3单抗对其进行预处理后移植,以观察GVHD预防效果。因本课题组构建的经典aGVHD模型为C57BL/6供鼠→BALB/c受鼠,而目前仅有CCR7-/-C57BL/6小鼠可供使用,且尚未有文献报道以C57BL/6小鼠作为受鼠的稳定aGVHD模型,囚此建立一个稳定的C57BL/6小鼠作为受鼠的aGVHD模型是本研究的关键。Megan Sykes等报道以B10.A作为供鼠,C57BL/6小鼠为受鼠,输注T细胞缺失的脾细胞和骨髓细胞建立无GVHD模型,观察GVL效应。本研究拟同样采用B10.A作为供鼠,输注不同数量的脾细胞和骨髓细胞,观察移植后受鼠的存活状况和GVHD严重程度,最终建立稳定的B10.A→C57BL/6aGVHD模型。在此基础上,因FcR在CCR7+DC清除中的作用尚未明确,若在FcR-/-C57BL/6小鼠中FB型CD3单抗不能有效清除CCR7+DC,我们拟对FcR-/-C57BL/6小鼠使用或不用FB型CD3单抗进行预处理,7天后照射受鼠及移植,比较受鼠生存状况和GVHD严重程度,以进一步验证CCR7+DC在GVHD中的作用。尽管FB型CD3单抗能有效地预防GVHD及保留GVL效应,但严重的“细胞因子风暴综合症”副作用限制其在临床广泛应用。为最大限度减轻副作用,美国FDA把FB型CD3单抗OKT3在人体内应用剂量定为5mg/75kg,约0.1μg/g。在本课题的研究中,我们使用的FB型CD3单抗剂量为5μg/g,远远高于FDA标准,使该预处理方案在临床难以应用。因FNB型CD3IgG3不引起“细胞因子风暴”,副作用小,且在治疗自身免疫性疾病方面已取得了较好的疗效,因此我们设计了FNB型CD3IgG3+FB型CD3单抗治疗方案,即受鼠先注射FNB型CD3IgG3(μg/g)12小时后予以注射FB型CD3单抗(5μg/g),7天后进行TBI及移植。结果表明该预处理方案不仅有效减轻了“细胞因子风暴综合症”,且在清除CCR7+DC及预防GVHD方面的疗效与单独使用FB型CD3单抗相近。BALB/c受鼠在移植后100天内100%全部存活,均无GVHD症状。为进一步探寻临床可用的预处理方案,我们拟在FNB型CD3IgG3(5μg/g)+FB型CD3单抗(5μg/g)基础上,逐步减少FB型CD3单抗剂量,或采用FDA批准的低剂量FB型CD3单抗(0.1gg/g)连续多次注射后照射移植,并观察GVHD预防效果,以寻找临床可用的预处理方案。方法1、对野生型C57BL/6小鼠予以静脉注射FB型CD3单抗或PBS作为对照,12小时后取MLN、PLN,应用冰冻组织切片技术及TUNEL分析对CCR7+DC进行荧光染色,共聚焦显微镜下观察CCR7+DC凋亡情况；应用流式细胞术方法检测CCR7+DC及CCR7-DC凋亡及Fas表达水平；2、对TNFa-/-FcγRI-/-C57BL/6小鼠予以静脉注射FB型CD3单抗或PBS,7天后取MLN、PLN,应用流式细胞术方法检测CCR7+DC百分比及数量；3、以野生型C57BL/6小鼠作为受鼠,予以11GyTBI,8小时后输注不同剂量的B10.A供鼠脾细胞和骨髓细胞,建立稳定的aGVHD模型,观察移植受鼠生存状况、GVHD严重程度；4、在构建稳定的B10.A→C57BL/6aGVHD模型基础上,移植前使用或不用FB型CD3单抗对野生型受鼠进行预处理,观察移植受鼠生存状况、GVHD严重程度；移植后5天,应用流式细胞术分别检测受鼠MLN、PLN中供者T细胞表达胃肠道和皮肤归巢趋化因子受体水平；5、以FcγRII-/-、CCR7-/-C57BL/6小鼠作为受鼠,移植前使用或不用FB型CD3单抗对野生型受鼠进行预处理,观察移植受鼠生存状况、GVHD严重程度；6、在经典的C57BL/6→BALB/c aGVHD模型基础上,采用FNB型CD3IgG3(5μg/g)+不同剂量的FB型CD3单抗(5,2.5,1.25,0.625,0μg/g),或连续5天注射低剂量FB型CD3单抗(0.1μg/gx5),7天后对BALB/c受鼠进行8Gy照射并移植,观察移植受鼠生存状况、GVHD严重程度。统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析,两组计量资料比较用两独立样本t检验进行统计学分析,各组数据以均数±标准差(x±s)描述,以P<0.05为差异具有统计学意义。生存分析采用Kaplan-Meier法,组间比较采用log-rank方法,以P<0.05为差异具有统计学意义。Prism软件作图。结果1、组织病理学检查显示野生型C57BL/6小鼠FB型CD3单抗处理后12小时CD11c+CCR7+DC凋亡细胞聚集成簇；CD11c+DC及D11c+CCR7+DC比例增加；处理组和对照组DC各亚群凋亡比例无明显差异,但处理组CD11c+CCR7+DC凋亡细胞数量增加有显著性意义,Fas表达水平上调。2、与PBS对照组相比,FB型CD3单抗处理第7天TNFa-/-、FcyRⅡ-/-C57BL/6小鼠MLN和PLN中CD11c+CCR7+DC细胞比例及数量减少有显著性意义。3、以B10.A作为供鼠,输注20×106全脾细胞和5×106骨髓细胞或输注5×106全脾细胞和5×106骨髓细胞至C57BL/6受鼠,可作为研究aGVHD的模型。4、在B10.A→C57BL/6aGVHD模型使用FB型CD3单抗预处理可以有效预防移植早期aGVHD,但不能缓解移植后期GVHD。移植后第5天,FB型CD3单抗预处理组受鼠MLN中供者CD4+/CD8+T细胞胃肠道归巢趋化因子受体α4β7和CCR9表达下调,差异有统计学意义。但实验组和对照组受鼠PLN中供者T细胞均不表达皮肤归巢趋化因子受体CCR4,CCR10。5.FcγRII-/-和CCR7-/-C57BL/6受鼠GVHD较野生型更为严重,FB型CD3单抗并不能有效缓解FcγRⅡ-/-和CCR7-/-C57BL/6受鼠GVHD。6、FNB型CD3IgG35μg/g+不同剂量的FB型CD3单抗剂量预处理方案中,FB型CD3单抗剂量需达到5μg/g才能达到完全预防GVHD的效果；连续多次小剂量注射FB型CD3单抗(0.1μg/g×5)预处理方案不能有效预防GVHD。结论1、FB型CD3单抗对CD11c+CCR7+DC清除的可能机制总结为：一方面,FB型CD3单抗处理释放细胞因子,引起DC上调CCR7,使DC从组织迁移至淋巴结内,并上调DC表达Fas水平,增加CD11c+CCR7+DC对凋亡的敏感性,TNFα等细胞因子对CD11c+CCR7+DC的清除无直接影响；另一方面,FB型CD3单抗结合T细胞表面CD3,活化T细胞,并可通过Fc段与CD11c+CCR7+DC表面的FcγRⅡβ结合,连接T细胞和DC,抑制细胞内的活化信号,促进杀伤CD11c+CCR7+DC。2、我们构建了稳定的B10.A→C57BL/6aGVHD新模型。在该模型中,FB型CD3单抗可以有效预防移植早期aGVHD,但不能有效预防移植后期GVHD。3、FB型CD3单抗预处理不能有效缓解FcγRⅡ-/-和CCR7-/-C57BL/6受鼠的aGVHD,CD11c+CCR7+DC可促进GVHD发生,但不足以完全介导GVHD。4、GVHD预防效果与FB型CD3单抗用量呈正相关,运用5μg/gFB型CD3单抗才能达到最佳的GVHD预防效果,减少其剂量并不能达到预期的理想疗效；连续多次小剂量注射方案虽然有效减轻“细胞因子风暴综合症”,疗效亦优于单次注射同等总剂量疗效,但仍不能达到理想的GVHD预防效果,有待设计一种更为有效的临床可行的抗CD3单抗预处理方案。