研究背景和目的： 乳腺癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率居女性恶性肿瘤首位并呈上升趋势，如何有效地预防和治疗乳腺癌成为人们关注的焦点。随着现代分子生物学的发展，研究者们逐渐认识到蛋白水平的磷酸化修饰是真核细胞信号通路调控的重要方式，它通过酪氨酸激酶（PTKs）的磷酸化作用和酪氨酸磷酸酶（PTPs）的去磷酸化作用进行调节。 本文在前期雌激素受体（ER）和HER2相互调节的研究中发现，HER2基因转入MCF-7乳腺癌细胞株后，非跨模型PIP分子SHP-1的表达明显下调。经Hercep-tin诱导耐药的T47D乳腺癌细胞中SHP-1的表达也是降低的。Yip等研究了19个乳腺癌细胞株和72份原发性乳腺癌标本进行检测，发现ER阳性的细胞株中SHP-1mRNA均表达或高表达，而10个ER阴性的细胞株中只有4株检测到SHP-1的表达，同时还发现58%的原发性乳腺癌细胞中SHP-1mRNA的水平呈2～12倍增高，这似乎与PTP作为肿瘤抑癌基因的特性相悖。进一步分析发现，这是生物体自身调控的结果，因为ER和HER2的表达往往是相反的，即ER高表达则HER2低表达或不表达，反之亦然。ER表达常常提示肿瘤细胞生长缓慢，恶性程度低。而HER2表达的肿瘤细胞恶性程度高，易侵袭转移。ER阳性的细胞中SHP-1高表达，恰恰是细胞调控HER2通路的一种方式。早期乳腺癌标本中出现SHP-1的高表达，也正是细胞抑制异常信号的一种自平衡表现。这种平衡的破坏，则导致磷酸化信号的过度活化，细胞恶性程度增加。为了验证这种假设，分别检测了30例早期的、Herceptin耐药的和转移性的乳腺癌标本，发现SHP-1的表达在耐药和转移性的标本中明显降低，证实本研究的推论。 在乳腺癌的发生当中，SHP-1主要涉及生长因子受体或非受体蛋白酪氨酸激酶的脱磷酸作用，通过去磷酸化起着重要的负性调节作用。作为一种新的肿瘤相关基因，SHP-1对肿瘤抑制功能已得到肯定，但其在乳腺癌中的具体作用机制仍不十分清楚。目前SHP-1作为酪氨酸磷酸酶在信号传导中的作用，其底物分子和表达的调控等也都尚未完全明确，探求其表达的调控机制，将有助于阐明其作为酪氨酸磷酸酶在信号传递及细胞周期中的作用，本研究通过克隆并表达SHP-1基因，探讨其具体的抑癌作用，为加强我们对乳腺癌发生、发展的认识，同时为寻找和开发新的抗肿瘤治疗手段奠定基础。 方法： 第一章、SHP-1基因真核表达载体的构建。 1．SHP-1基因的克隆从SHP-1高表达的人乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA，逆转录为cDAN，PCR扩增获得全长SHP-1基因，回收纯化；用T4DNA连接酶将SHP-1基因连入通用载体pGEM-TEasy中，转化、铺板、挑选菌落，扩增培养，常规抽提质粒，测序鉴定。 2．真核表达载体pcDNA3．1（+）-SHP-1的构建限制性内切酶HindⅢ和EcoⅠ双酶切pcDNA3．1（+）载体，回收纯化，得到pcDNA3．1（+）线性质粒。EcoRⅠ单酶切连入通用载体pGEM-TEasy中的SHP-1基因，胶回收纯化SHP-1基因片段。将SHP-1基因经TA克隆后连入PMD18-T载体中并再次经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，以T4连接酶将SHP-1基因双粘片段和pcDNA3．1（+）线性质粒连接，转化感受态菌DH5α，挑取阳性克隆，质粒小量提取后，所获阳性重组子测序鉴定。 第二章、SHP-1基因在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达和生物学特性的初步观察。 1．SHP-1基因真核表达载体转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231用Lipofectamine2000介导pcDNA3．1（+）-SHP-1质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞株后，用G418筛选稳定表达SHP-1基因的MDA-MB-231-SHP-1细胞克隆。pcDNA3．1（+）空载体转染MDA-MB-231细胞做对照。克隆环分离单个克隆于6孔板中（共选6个克隆），加入G418选择性培养液继续培养2w。4w后G418改为600μg/ml维持筛选。6孔板长满后，转接到25mm的培养皿中传代培养，最后用含600μg/mlG418的完全培养基扩大培养，用于下一步鉴定及生物学实验。 2．SHP-1基因表达的鉴定和稳定转染细胞的生物学特性的初步观察RT-PCR检测SHP-1基因在转染细胞中mRNA水平的表达，免疫细胞化学及Western blot鉴定转染后SHP-1基因在转染细胞中的蛋白表达，通过MTT法，检测SHP-1对乳腺癌细胞体外增殖能力的影响。 结果： 第一章、SHP-1基因真核表达载体的构建。 1．从MCF-7乳腺癌细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增，PCR电泳结果显示一条约1．8Kb大小的特异性条带，与预期的SHP-1基因的大小相吻合。 2．连入通用载体pGEM-TEasy中的SHP-1基因序列经EcoRⅠ单酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示可见约1．8Kb的目的片段和约3Kb的载体片段，测序鉴定，结果表明与GenBank中SHP-1序列完全一致。 3．酶切后的SHP-1基因片段经TA克隆与PMD18-T载体连接，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后与双酶切后的pcDNA3．1（+）线性质粒连接。连接产物转化感受态细菌DH5α，挑取阳性克隆，质粒小量提取后，对pcDNA3．1（+）-SHP-1重组质粒进行双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果显示约1．8Kb的目的片段和约5．4Kb的载体片段。连接产物经测序鉴定，结果表明与GenBank中SHP-1序列完全符合。 第二章、SHP-1基因在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达和生物学特性的初步观察。 1．稳定转染pcDNA3．1（+）-SHP-1质粒的MDA-MB-231细胞株能在G418浓度为600μg/ml的RPMI-1640选择培养基中生长，筛选出稳定表达SHP-1基因的MDA-MB-231-SHP-1细胞克隆。 2．RT-PCR结果从稳定转染的MDA-MB-231-SHP-1细胞株中可在mRNA水平检测到SHP-1基因表达，而转染空载体的MDA-MB-231-pcDNA3．1（+）则未检测到。 3．免疫细胞化学结果分别对MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-231-SHP-1和MDA-MB-231-pcDNA3．1（+）细胞株采用EnVisionTM法进行SHP-1蛋白免疫细胞化学检测，结果显示MCF-7、MDA-MB-231-SHP-1细胞浆呈棕黄色，表明SHP-1蛋白有表达并主要定位于细胞胞浆，而MDA-MB-231、MDA-MB-231-pcDNA3．1（+）细胞胞浆未见着色。 4．Westernblot结果分别从MCF-7、MDA-MB-231、稳定转染SHP-1的MDA-MB-231-SHP-1和转染空载体的MDA-MB-231-pcDNA3．1（+）中提取总蛋白经Westernblot检测，结果表明MCF-7、MDA-MB-231-SHP-1在蛋白水平可以检测到SHP-1的表达，而MDA-MB-231、MDA-MB-231-pcDNA3．1（+）在蛋白水平未检测到SHP-1的表达。 5．采用MTT法检测三组细胞的生长特性，结果表明与转空载体组和未处理组相比，转染SHP-1基因的MDA-MB-231-SHP-1细胞增殖明显受抑。 结论： 1．本实验成功克隆人全长SHP-1基因，构建了pcDNA3．1（+）-SHP-1真核表达载体，经双酶切鉴定，测序分析证实其基因序列与GenBank中SHP-1序列完全一致。 2．重组质粒pcDNA3．1（+）-SHP-1转染MDA-MB-231细胞株后用G418筛选出了稳定表达SHP-1基因的MDA-MB-231-SHP-1细胞株；经RT-PCR、免疫细胞化学及Westernblot检测分析，转染SHP-1基因后的MDA-MB-231-SHP-1细胞在mRNA水平和蛋白水平均有表达；MTT法绘制生长曲线显示，与未转染的MDA-MB-231细胞及转染空载体的MDA-MB-231-pcDNA3．1（+）细胞相比，转染SHP-1基因的MDA-MB-231细胞其增殖率明显降低，提示SHP-1基因表达后能明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖。