RNA结合蛋白（RBP）是一类能与RNA结合来发挥其生物学活性的的蛋白质,在转录后调节中扮演着重要角色。异常表达的RNA结合蛋白与肿瘤的发生和发展关系密切。作为蛋白中的一类,RNA结合蛋白在肿瘤中的异常表达与基因组的改变、转录后调控和翻译后调控相关。由于作为上游因子调控下游RNA的表达、修饰、稳定性等,即使非常小的改变也可以对下游基因产生重大的影响。现在,对于RNA结合蛋白调节下游RNA在肿瘤中的发生及发展的机制仍然有很多问题是未知的,这值得进一步研究。NELFE是RNA结合蛋白家族的一员,对其在肿瘤中的功能报道不多。本实验室前期研究发现NELFE作为RNA结合蛋白通过调控下游RNA在肝癌中具有明显的促癌作用,因此我们检测胃癌组织发现NELFE在胃癌中也是高表达,胃癌细胞中瞬转NELFE的si RNA后胃癌的增殖和转移功能受到明显抑制,推测NELFE可能也参与了胃癌的发生发展。本课题拟研究NELFE在胃癌中的发生发展中的机制,为胃癌的治疗寻找新靶点,为胃癌的临床治疗提供更多的理论依据。第一部分:NELFE促进胃癌增殖转移通过对组织样本的检测,分析NELFE在胃癌和癌旁中的表达情况及NELFE的表达与临床病理参数的关系;细胞水平探索NELFE对胃癌细胞功能的影响;裸鼠体内验证NELFE对胃癌细胞成瘤能力和转移能力的影响。方法:1.通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和western blot的方法检测32对新鲜胃癌组织及配对的正常胃黏膜中NELFE的表达量,初步探索NELFE与胃癌的关系;免疫组化法检测224对完成了五年随访的胃癌患者的病理切片,免疫组化评分分析NELFE的表达强度,分析NELFE的表达与临床病理参数的关系,分析NELFE的表达与胃癌患者预后的关系。2.western blot检测胃癌细胞中NELFE的表达,选取合适的细胞进行功能验证;构建NELFE干扰慢病毒,建立稳定低表达NELFE的胃癌细胞,利用稳定低表达NELFE的细胞进行体外功能实验,MTT、克隆形成、transwell实验验证敲低NELFE对细胞增殖和转移功能的影响。3.采用低表达NELFE的细胞株构建裸鼠模型。皮下成瘤实验中测量肿瘤的大小及重量,观察NELFE对肿瘤生长的影响;尾静脉注射构建肺转移,观察NELFE的敲除对胃癌体内转移的影响。结果:1.新鲜胃癌组织及配对的正常胃黏膜中,NELFE的RNA和蛋白水平在胃癌组织中均升高;免疫组化结果发现胃癌组织中NELFE强表达的比例较高,正常胃组织中NELFE强表达比例较低而弱表达比例较高;NELFE的表达量与肿瘤的大小及分期相关,肿瘤越大、分期越晚的患者NELFE高表达越多。随访结果发现更高的NELFE表达的患者,无论是总生存（OS）还是无进展生存（RFS）率更低。2.用western blot检测六株胃癌细胞系（BGC-823,AGS,SGC-7901,HGC-27,MKN-45 and MGC-803）中NELFE的表达量,NELFE在BGC-823和AGS表达最高;免疫荧光实验发现NELFE在细胞核和细胞质中均有分布,为后期研究NELFE的作用机制提供依据;MTT实验显示低表达NELFE后胃癌细胞增殖能力明显减弱;克隆形成实验显示低表达NELFE后细胞所形成的集落数明显减少;transwell实验显示低表达NELFE后胃癌细胞的侵袭和转移能力减弱。3.体内实验中,皮下成瘤实验显示敲低NELFE后胃癌细胞的体内成瘤能力明显减弱;尾静脉注射胃癌细胞发现敲低NELFE后胃癌细胞的肺转移能力减弱。结论:本部分利用新鲜标本和病理切片发现NELFE在胃癌中高表达,高表达NELFE与病理特征和预后相关。体内外功能实验均证实敲低NELFE可以抑制胃癌体内外的增殖和转移能力,这表明NELFE在胃癌中是促癌基因,可以促进胃癌的发生发展。第二部分:NELFE通过稳定E2F2的RNA来促进胃癌进展通过对稳定低表达NELFE的细胞进行转录组测序,筛选出下游基因;RNA衰减实验、RIP、pulldown、荧光素酶实验验证NELFE对下游基因E2F2的调控。方法:1.稳定低表达NELFE的BGC-823和AGS细胞分别送两个公司进行RNA-seq,将两个细胞的测序结果取交集,筛选出下游目的基因,PCR和western blot再次验证稳定低表达细胞中E2F2的RNA和蛋白水平。2.RNA衰减实验检测NELFE敲除后对E2F2基因RNA保护功能的影响;RNA结合蛋白免疫沉淀实验验证NELFE与下游基因的结合;荧光素酶实验、pulldown实验验证NELFE与下游基因3’UTR的特异性结合。3.免疫组化法检测20对胃癌病理切片中E2F2的表达;实时荧光定量PCR方法检测32对新鲜胃癌组织及配对的正常胃黏膜中E2F2的表达量,探索NELFE与E2F2在胃癌组织中表达相关性。结果:1.稳定低表达NELFE的细胞转录组测序后,分别取两个细胞中下调明显的基因取交集,23个基因明显低表达,选取E2F2作为下游靶点,稳定低表达NELFE细胞中E2F2的RNA和蛋白表达量均呈现明显下降趋势。2.衰减实验中,敲低了NELFE的细胞中E2F2的RNA的量降解的速度明显快于正常表达NELFE的细胞;RNA结合蛋白免疫沉淀实验证实NELFE可以与E2F2的RNA结合;荧光素酶实验和pulldown实验均证实NELFE是通过与E2F2的3’UTR结合,而不是与5’UTR或者CDS区结合。结论:本部分通过转录组测序筛选出NELFE的下游基因E2F2,机制上证实NELFE通过与E2F2转录本的3’UTR结合来稳定其RNA。第三部分:E2F2促进胃癌增殖转移细胞水平探索E2F2对胃癌细胞功能的影响;裸鼠体内验证E2F2对胃癌细胞成瘤能力和转移能力的影响;回复实验验证E2F2对敲除NELFE导致其功能减弱的挽救。方法:1.western blot检测胃癌细胞中E2F2的表达,选取合适的细胞进行功能验证;构建E2F2干扰慢病毒,建立稳定低表达E2F2的胃癌细胞,利用稳定低表达E2F2的细胞进行体外功能实验,MTT、克隆形成、transwell实验验证敲低E2F2对细胞增殖和转移功能的影响。2.采用低表达E2F2的细胞株构建裸鼠模型。皮下成瘤实验中测量肿瘤的大小及重量,观察E2F2对肿瘤生长的影响;尾静脉注射构建肺转移,观察E2F2的敲除对胃癌体内转移的影响。3.回复实验:在稳定低表达NELFE的细胞中高表达E2F2,通过MTT、克隆形成、transwell实验验证E2F2对敲除NELFE后细胞的增殖和转移功能减弱的挽救。结果:1.用western blot检测BGC-823,AGS,SGC-7901,HGC-27,MKN-45、MGC-803中E2F2的表达量,E2F2在BGC-823和AGS表达最高;MTT实验显示低表达E2F2后胃癌细胞增殖能力明显减弱;克隆形成实验显示低表达E2F2后细胞所形成的集落数明显减少;transwell实验显示低表达E2F2后胃癌细胞的侵袭和转移能力减弱。2.体内实验中,皮下成瘤实验显示敲低E2F2后胃癌细胞的体内成瘤能力明显减弱;尾静脉注射胃癌细胞发现敲低E2F2后胃癌细胞的肺转移能力减弱。3.回复实验中,MTT、克隆形成、transwell实验均显示在敲低NELFE的细胞中高表达E2F2后,因敲低NELFE导致的的细胞增殖和转移能力减弱现象均被部分增强。结论:独立的E2F2功能实验证实敲低E2F2可以抑制胃癌体内外的增殖和转移能力,回复实验证实E2F2可以部分挽救NELFE敲低导致细胞功能所受的抑制。综上,我们得出:NELFE具有促进胃癌增殖和转移的功能,其促癌作用是通过调控E2F2的稳定性从而促进E2F2的表达增多来实现。