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鸡贫血病毒（Chicken anemia virus,CAV）是以免疫抑制为主要特征的鸡传染性贫血病的病原。天然免疫受体NLRs（Nucleotide-binding domain,leucine rich repeat receptors）家族中NLRC5（NLR family,CARD domain containing protein 5）为近年来发现调控MHCI（Major histocompatibility complex I）转录的关键因子。鸡MHCI又名B复合体（B complex class I,BF）,包括主基因座（BF2）和次基因座（BF1）。目前,有关CAV感染是否影响鸡NLRC5调控BF及其调控机理尚未清楚,本研究首先克隆表达、制备NLRC5抗体,其次应用真核细胞转染、荧光定量以及构建双荧光素酶检测系统等方法,检测CAV感染时淋巴细胞中NLRC5/MHCI及其相关分子的转录水平变化,进而分析该病毒的活性蛋白VP1、VP2和VP3对NLRC5以及NLRC5对MHCI（BF1和BF2）基因的调控,从而为揭示CAV感染调控NLRC5/MHCI从而影响宿主免疫应答的分子机制奠定基础。（1）NLRC5基因克隆、原核表达与抗体制备以鸡肝组织c DNA为模板通过设计的引物扩增其N端1-663bp（DD结构域）基因片段,经Nde I和Xba I双酶切连接至p Cold载体转化E.coli中获得NLRC5重组菌,以IPTG低温诱导后经镍亲和柱纯化融合蛋白作为免疫原经皮下多点注射新西兰兔,制备兔源抗NLRC5多克隆抗体（anti-NLRC5）。经western blot方法检测结果显示,制备的anti-NLRC5多克隆抗体能有效识别35k Da重组蛋白NLRC5-DD。（2）NLRC5在真核细胞中表达与定位应用PCR以鸡肝组织c DNA为模板克隆NLRC5最长编码区基因序列,连接p EGFP-C1真核表达载体,构建p EGFP-C1-NLRC5重组质粒,以脂质体介导分别转染HEK293T和鸡DF-1细胞,观察GFP-NLRC5的表达,以anti-NLRC5抗体和对照抗体anti-GFP对细胞表达蛋白进行Western blot检测。结果显示,与对照细胞相比,NLRC5过表达主要分布于细胞核,通过Western blot方法可检测过表达的NLRC5蛋白。（3）CAV感染诱导鸡淋巴细胞MDCC-MSB1（简称MSB1）中相关基因的转录表达以100 TCID50/m L CAV病毒液感染MSB1细胞,通过RT-q PCR检测病毒孵育0～48h细胞内病毒增殖情况（衣壳蛋白VP1）以及NLRC5、MHCI和MHCII基因的m RNA水平。结果显示,NLRC5在病毒感染后6h显著下调,之后持续上调,在检测时间段内以48h转录水平上调最为明显,而在36-48h时病毒的增殖较为显著,与此对应,MHCI表达在36-48h与初始12h相比上调显著,MHCII则在24h显著上调并达峰值,而在病毒增殖明显时（36-48h时）显著下降。由此说明,CAV在感染不同进程中能引起细胞中NLRC5及相关基因MHCI的转录变化。（4）通过双荧光素酶报告基因系统检测病毒蛋白与NLRC5/MHCI的调控关系以100 TCID50/m L CAV病毒液感染MSB1细胞,提取细胞DNA为模板扩增CAV-VP1、VP2、VP3基因连接至p CMV-myc载体。设计扩增启动子引物,以上述DNA为模板分别扩增NLRC5、BF1、BF2启动子区域连接至PGL3-basic载体。以重组质粒p EGFP-C1-NLRC5为模板扩增NLRC5基因序列连接至p CMV-myc载体。合成鸡干扰素IFN-γ序列并连接至p CMV-myc载体。将上述载体转染DF-1细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检测NLRC5对BF1、BF2启动子活性影响。结果显示,鸡NLRC5启动BF2而不是BF1的表达;IFN-γ可正向调控NLRC5和BF2的表达;VP1、VP2、VP3均可正向调控NLRC5表达,其中,VP2蛋白调控作用最显著,且发现VP2虽然可以直接激活NLRC5,但是其对BF2的调控必须依赖IFN-γ的存在。综上所述,本研究首先克隆鸡NLRC5基因,通过原核表达制备兔源抗NLRC5多克隆抗体,应用该抗体可以检测NLRC5过表达蛋白。以CAV感染淋巴细胞MSB1时,发现其能够诱导NLRC5与MHCI相应变化。继而建立双荧光素酶报告基因系统,明确CAV活性蛋白VP1、VP2、VP3（尤其是VP2）能显著调控NLRC5表达,且NLRC5可以主要启动BF2。因而说明CAV感染以VP2为关键蛋白,通过调控NLRC5/MHCI的表达从而影响鸡免疫系统的应答反应。