大蒜果聚糖代谢酶及黑蒜中糖与5-HMF的研究

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大蒜果聚糖是大蒜中的重要活性成分之一。在大蒜生长、贮存过程中,大蒜果聚糖代谢酶对大蒜果聚糖的分子特征有着重要的影响。为明确大蒜中果聚糖的变化规律,本论文采用硫酸铵盐析法粗分大蒜果聚糖合成酶(FBE)及大蒜果聚糖水解酶(FEH),用ConASepharose亲和层析、DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析等方法对其予以细分,进而采用denovo测序法测定目的条带的氨基酸序列,然后与其它植物中的1-FEH以及大蒜克隆的FEH进行序列比对。此外,用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定黑蒜加工过程中的果糖和蔗糖;用苯酚硫酸法测定其总果聚糖;用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定其5-羟甲基糠醛(5-HMF)的变化规律。取得了如下结果:(1)部分纯化了1-FEH,对Pro-gel分析所得条带进行测序得到该酶的两个肽段的氨基酸序列,分别是PADHYPAYMNDTNR和ILKSGKHGPKCGEGER,但经BLAST序列比对发现此条带不同于已经发现的其他植物1-FEH,可能是一新型的果聚糖水解酶。(2)证实1-SST活性主要存在于30%-40%硫酸铵沉淀部分的粗酶液中。(3)建立HPLC-ELSD分离六种糖的分离方法,其分离方法为:Prevail carbohydrate ES糖柱梯度洗脱,梯度条件为:0min,75%乙腈水;15min,65%乙腈水;30min,50%乙腈水;40min,25%乙腈水,柱温箱温度40℃,流速1mL/min,ELSD撞击器关,漂移管温度90℃,载气流量2.5L/min(空气)。该方法对果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的检测限分别是30、80、100、100、100、100ng之间,回收率分别是98.4%、91.7%、95.6%、93.6%、98.2%、98.7%,精密度RSD为0.31%,精确度是95%。(4)分离鉴定了与黑蒜成熟度有关的物质5-HMF,在70℃、80℃、90℃三个温度下其生成规律符合一级反应,其阿累尼乌斯方程式是ln K=-3862.5(1/T)+7.98。其表观活化能为32.11kJ mol-1。(5)黑蒜加工过程中,蔗糖在低温下呈增加的趋势而高温条件下呈减少的趋势,果聚糖在低温条件下基本不变,高温条件下逐渐减少;通过冷冻处理的大蒜可以更快得到黑蒜成品;紫蒜中的果聚糖含量要高于白蒜;热解作用所致的果糖生成量要高于果糖参加美拉德反应等的降解量,造成黑蒜产品含有大量的果糖(可高达200mg/g)。冻白蒜,紫蒜和白蒜形成果糖的阿累尼乌斯方程分别是:ln K=-2887.1x+3.87;ln K=-24186x+64.25;ln K=-5914.6x+12.09。其表观活化能分别是24、201.08和49.17kJ mol-1。
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