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Kisspeptin是由KISS1基因编码的前体蛋白水解得到的一系列小肽,是GnRH分泌最强有效的促进剂。在哺乳动物中,Kiss1的定时激增决定了 GnRH的定时激增:Kiss1神经元表达大量雌激素受体,介导了排卵前的雌激素正反馈和非排卵期的雌激素负反馈作用;Kiss1基因表达呈脉冲式,在雌激素条件下,脉冲表达的均值呈现昼夜节律;脉冲式的Kiss1使得GnRH神经元同步化。依赖于Kisspeptin神经元对雌激素信号和生物钟信号的整合作用,使GnRH的分泌高峰呈现雌激素依赖性的日节律模式。然而,Kisspeptin系统和功能在不同物种间差异很大。在斑马鱼等大多数脊椎动物中kisspeptin有两个拷贝。斑马鱼Kisspeptin的功能目前还不明确。斑马鱼中kisspeptin是否还受到生物钟的调控,是否响应雌激素信号?斑马鱼的kisspeptin有什么样的功能?斑马鱼两个Kiss1同源基因的表达模式和在生殖中的具体功能还未有阐明。因而,本论文旨在探索1.斑马鱼kisspeptin基因在斑马鱼生殖中的具体作用;2.生物钟是否直接调控kisspeptin基因的表达及如何调控?3.kisspeptin基因如何响应雌激素的刺激?4.生物钟蛋白是否与雌激素受体协同调控kisspeptin基因表达?5.以斑马鱼bmal1b-/-为模型,探索生物钟紊乱如何对kisspeptin基因表达产生影响,从而影响生殖。我们构建了热激诱导过表达kiss1和kiss2转基因鱼。通过多肽注射和热激诱导kiss1和kiss2过表达后的产卵实验,我们的研究揭示了斑马鱼kisspeptin通路对生殖可能的作用机制。从而发现,Kiss1是一种gnrh3/lhb的激活因子,Kiss2是一种gnrh3/lhb的抑制因子。我们利用RT-qPCR发现斑马鱼两个kisspeptin基因的mRNA水平都存在明显的振荡,但模式不同,kiss1和kiss2的表达峰值分别在ZT4和ZT3。我们用生物信息学软件对比分析了人,小鼠和斑马鱼的启动子区域,发现不同基因间调控元件有一定差异。双荧光素报告酶实验与ChIP实验从体外和活体两个水平揭示生物钟对两个kisspeptin基因调节的不同方式:生物钟通过钟控元件E-box调节kiss1基因;通过钟控元件D-box和RRE元件调节kiss2基因;在活体内不同生物钟蛋白对相应的功能性钟控元件的结合呈现日节律,但时相各不相同。Bmal1b对kiss1启动子E-box结合峰值在ZT20;Tefa和Rorαa对kiss2的D-box和RRE的结合峰值分别在ZT8和ZT16。我们构建了kiss1和kiss2启动子驱动的虫荧光素酶基因转基因鱼,观察到了kiss1与kiss2基因在生物钟bmal1b-/-突变体的表达改变,kiss1和kiss2的振幅都降低,kiss2振幅的降低更显著,同时kiss2的表达峰值在ZT0,相位后移约4h。雌激素处理实验发现雌激素可能是通过Esr2a对kisspeptin起作用。双荧光素报告酶实验表明雌激素受体在雌激素存在条件下激活kissl基因表达,并通过与生物钟蛋白Crylaa的直接结合,一起调控kiss1基因表达;雌激素受体可以在雌激素存在下激活kiss2基因表达,虽不与调控kiss2基因的生物钟蛋白直接结合,但它们的激活有加成。我们还发现了不依赖于雌激素的雌激素受体相关受体对kiss2基因表达激活作用,可能涉及代谢通路对kiss2的调控。综上所述,我们的研究发现生物钟可以直接调控斑马鱼kiss1与kiss2基因的表达,在雌激素存在的情况下,生物钟蛋白可以与雌激素受体共同作用调节kisspeptin基因的表达。生物钟的紊乱导致bmal1b-/-中kisspeptin基因的表达的变化,影响了gnrh3/lhb的表达,产卵量降低。我们的研究为以斑马鱼为模型研究生物钟蛋白与雌激素受体协同作用导致Kiss1定时激增的具体机制提供了基础。同时,我们的研究结果扩充了比较生物学的知识:D-box调节kisspeptin基因是小鼠和斑马鱼共有的机制;E-box调节kisspeptin基因是人和斑马鱼共有的机制,小鼠不具有。人或小鼠Kiss1基因启动子没有钟控元件RRE,生物钟通过该元件对kiss2基因调控,是斑马鱼独有的一种调节机制。此外,我们构建的kiss1和kiss2启动子驱动的荧光素酶基因转基因鱼,以及热激诱导过表达kiss1和kiss2转基因鱼,为后续生物钟对kisspeptin基因调控机制,对kisspeptin基因功能,及生物钟紊乱对kisspeptin基因功能所造成影响的深入研究提供了有力的工具。