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胃癌(Gastric cancer, GC)是消化系统中常见的恶性肿瘤之一.高侵袭性和高转移性是胃癌的主要恶性生物学特性,也是导致患者预后不良的根本原因,但其机制至今尚未明了.因此,深入研究胃癌侵袭转移的机制对于发展新的更有效的胃癌治疗方法具有极为重要的意义. 离子通道是一类重要的膜整合蛋白,在细胞膜上选择性地传输离子而参与细胞的各种生命活动.钾离子通道是离子通道中分布最广、种类最多的一类离子通道,共有78 种,基于其结构和激活方式,可分为四类:电压门控钾离子通道( Voltage-gated potassium channels,Kv),钙激活钾离子通道(Calcium-activated potassium channels, KCa),内向整流钾离子通道(Inward rectifying potassium channels, Kir)和双孔域钾离子通道(Two-pore domain potassium channels,K2P).钾离子通道在细胞的膜电位形成、激素分泌、增殖、凋亡和迁移运动等中发挥重要功能.近年来的研究发现,钾离子通道在多种肿瘤中呈现异常表达或功能紊乱,在肿瘤细胞的增殖、耐药、迁移、侵袭和转移等恶性生物学行为中发挥重要作用.但钾离子通道在胃癌侵袭和转移中的作用及其分子机制尚缺乏深入研究. 本研究中,我们建立起侵袭性和非侵袭性胃癌细胞模型,利用全细胞膜片钳技术检测其钾电流水平.相比非侵袭性胃癌细胞,侵袭性胃癌细胞表达更强的钾电流,且电流密度-电压曲线(pA/pF-V curve)显示其具有典型的内向整流钾电流(Inward rectifying potassium current,IK+)特征.用qRT-PCR筛查到侵袭性与非侵袭性胃癌细胞中表达差异最大的 Kir 家族分子成员为 Kir2.1.实验证实,Kir2.1 显著促进胃癌细胞的侵袭转移能力并与诱导 EMT 表型相关,但不依赖其离子通道功能本身.进一步实验发现,Kir2.1能与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38(Serine/threonine-protein kinase 38, Stk38 )相互作用而减弱 E3 泛素化连接酶 Smurf1 对丝裂原活化蛋白激酶激酶 2 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2, MEKK2)的泛素化降解,致使MEKK2积累而激活下游MEK1/2-ERK1/2-Snail信号通路,诱导EMT从而促进胃癌细胞的侵袭转移.临床胃癌样本的免疫组化检测结果和数据库资料的分析证实, Kir2.1在胃癌组织中显著高表达,其表达水平与胃癌的T分期、淋巴结转移和TNM分期呈显著正相关,而与患者的预后呈显著负相关,是一个潜在的新的胃癌患者预后标志物和治疗靶点. 本研究的主要方法、结果及结论如下: 1. Kir2.1促进胃癌细胞侵袭转移的作用 (1)侵袭性胃癌细胞较非侵袭性胃癌细胞呈现更强的IK+ 我们采用Matrigel-Transwell方法获取侵袭性和非侵袭性胃癌细胞,全细胞膜片钳技术检测钾电流水平发现,胃癌细胞系MGC803和原代胃癌细胞XN0422中侵袭性胃癌细胞在-100mV下的平均钾电流密度显著高于非侵袭性胃癌细胞(p< 0.05).其pA/pF-V曲线呈现典型的IK+曲线特征,提示Kir家族在胃癌细胞侵袭中发挥重要作用. (2)侵袭性胃癌细胞高表达功能性Kir2.1 Kir家族包括15个成员, qRT-PCR筛查发现其中Kir2.1在侵袭性和非侵袭性胃癌细胞中的表达差异最大(差异倍数=13.3),并得到蛋白印迹(Western blot)实验证实.利用全细胞膜片钳实验收集高IK+(> 50 pA)和低IK+(<5 pA)的胃癌细胞, qRT-PCR检测Kir2.1的表达水平发现,高IK+细胞显著高表达Kir2.1(p< 0.0001),表明胃癌细胞中的IK+主要是由Kir2.1所产生.提示Kir2.1参与胃癌细胞的侵袭能力的调控. (3)Kir2.1high细胞具有高侵袭转移能力 采用流式细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)获得Kir2.1高表达(Kir2.1high)和Kir2.1低表达(Kir2.1low)胃癌细胞亚群.体外侵袭实验发现,分选自MGC803和 XN0422细胞的Kir2.1high细胞较Kir2.1low均具有更强的侵袭能力(均p<0.0001);小鼠腹腔转移模型显示Kir2.1high较Kir2.1low细胞均具有更强的体内转移能力(均p< 0.0001).这些结果表明Kir2.1的表达水平与胃癌细胞的侵袭转移能力具有正相关关系. (4)沉默/过表达Kir2.1显著改变胃癌细胞的侵袭转移能力 稳定沉默Kir2.1表达(sh-Kir2.1) 显著降低MGC803和XN0422胃癌细胞的体外侵袭能力和体内转移能力(均p< 0.0001).相反,稳定过表达Kir2.1(over-Kir2.1)显著增强MGC803和XN0422胃癌细胞的体外侵袭和体内转移能力(均p< 0.0001).这些结果表明Kir2.1是促进胃癌细胞的侵袭转移的重要分子. 2. Kir2.1促进胃癌细胞EMT和侵袭不依赖其离子通道功能 (1)Kir2.1特异性抑制剂和激动剂不改变胃癌的侵袭能力 Kir2.1 特异性抑制剂 ML133 能完全抑制 over-Kir2.1 胃癌细胞的 IK+,激动剂Zacopride可以显著增强胃癌细胞的IK+.但ML133和Zacopride处理对胃癌细胞的侵袭能力几无影响.结果提示尽管胃癌细胞表达的Kir2.1是功能性的,但其促进胃癌细胞侵袭转移的作用却与其传输钾离子的功能无关. (2)过表达钾离子通道突变型Kir2.1不增加胃癌细胞IK+但增强其侵袭能力 将Kir2.1的离子转运核心结构域Gly-Tyr-Gly突变为Ala-Ala-Ala,建立稳定过表达突变型Kir2.1的胃癌细胞株(mut-Kir2.1).全细胞膜片钳检测发现,mut-Kir2.1细胞与对照细胞中IK+无显著差异.但体外侵袭实验却发现,mut-Kir2.1细胞的侵袭能力与对照细胞相比显著增强,与over-Kir2.1细胞相当.这些结果进一步证实Kir2.1促进胃癌的侵袭不依赖其钾离子通道功能. (3)Kir2.1诱导胃癌细胞发生EMT 过表达Kir2.1显著降低 E-cadherin的表达,而显著增加Vimentin和Snail的表达.相反,沉默Kir2.1显著上调E-cadherin的表,而显著下调Vimentin和Snail的表达.表明Kir2.1在诱导胃癌细胞EMT中发挥重要作用. (4)Kir2.1诱导胃癌细胞发生EMT不依赖其离子通道功能 Kir2.1 特异性的抑制剂 ML133 和激动剂 Zacopride 分别处理胃癌细胞,不引起E-cadherin、Vimentin 和 Snail 的表达水平显著变化;但 mut-Kir2.1 胃癌细胞与over-Kir2.1细胞中E-cadherin、Vimentin和Snail的表达水平相当.这些结果表明Kir2.1诱导胃癌细胞发生EMT不依赖其钾离子通道功能. 3. Kir2.1激活MEKK2通路促进胃癌细胞侵袭转移 (1)Kir2.1激活ERK1/2通路 采用磷酸激酶抗体芯片筛选Kir2.1的下游信号通路发现,过表达Kir2.1引起胃癌细胞中多条磷酸激酶信号通路的激活,其中以 ERK1/2 通路的激活最为显著(差异倍数=3.3),并在过表达和敲低Kir2.1的胃癌细胞中得到Western blot的验证.这些结果提示,ERK1/2信号通路可能是Kir2.1调控胃癌细胞侵袭转移的主要下游通路. (2)Kir2.1促进胃癌细胞侵袭依赖MEK1/2-ERK1/2-Snail通路 用ERK1/2上游分子MEK1/2的特异性抑制剂PD98059处理胃癌细胞,显著阻断过表达Kir2.1引起的p-ERK1/2和p-MEK/2表达上调、E-cadherin、Vimentin和Snail表达改变以及侵袭能力增强,表明MEK1/2-ERK1/2-Snail信号通路在Kir2.1诱导胃癌细胞发生EMT以及促进胃癌细胞侵袭中发挥重要作用. (3)Kir2.1促进胃癌细胞侵袭不依赖Raf 用MEK1/2上游分子Raf(包括A-Raf, B-raf和C-raf)的抑制剂LY3009120处理胃癌细胞,显著降低胃癌细胞 p-A-raf、p-B-raf 和 p-C-raf 表达水平,但几乎不影响over-Kir2.1 胃癌细胞的 p-MEK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin、Vimentin 和 Snail 的表达水平以及侵袭能力.这些结果表明,Kir2.1激活胃癌细胞中MEK1/2-ERK1/2-Snail信号通路不依赖于Raf分子. (4)Kir2.1能够与Stk38相互作用 在over-Kir2.1细胞中利用Kir2.1的标签抗体进行免疫沉淀,质谱分析显示有多种蛋白与 Kir2.1 存在相互作用,结合文献筛选发现其中只有 Stk38 和 Rock2 参与了ERK1/2信号通路的调控.Co-IP实验验证表明,Stk38能与Kir2.1相互作用而Rock2则不能.免疫荧光实验显示,Stk38 与 Kir2.1 共定位于胃癌细胞的细胞膜和细胞浆.进一步实验证明,Kir2.1与Stk38相互作用的位点在其C端(aa179-425)区域.这些结果提示Kir2.1可能通过与Stk38相互作用而调控下游信号通路. (5)Kir2.1激活MEK1/2-ERK1/2-Snail通路依赖于Stk38和MEKK2 在 over-Kir2.1 细胞中过表达 Stk38,能够阻断过表达 Kir2.1 引起的胃癌细胞p-ERK1/2、p-MEK1/2 及 EMT 相关分子的变化和侵袭能力的增强,表明 Kir2.1 激活MEK1/2-ERK1/2-Snail 信号通路依赖于 Stk38.而且,过表达 Stk38 还引起MEK1/2-ERK1/2 通路的非经典上游分子 MEKK2 的减少,在 over-Kir2.1 细胞中沉默MEKK2的表达能够阻断过表达Kir2.1引起的胃癌细胞p-ERK1/2和p-MEK1/2表达水平的上调.这些结果表明,Kir2.1 通过 MEKK2-MEK1/2-ERK1/2-Sanil信号通路促进胃癌细胞EMT以及侵袭转移,而Stk38涉及在此调控过程中. (6)Kir2.1与Stk38相互作用抑制MEKK2的泛素化降解而激活MEK1/2-ERK1/2通路 定量Co-IP实验结果显示,过表达Kir2.1能够显著抑制胃癌细胞中Stk38-Smurf1复合体的形成.泛素化实验表明,共表达Stk38和Smurf1显著促进胃癌细胞中MEKK2的泛素化,但这一作用能被过表达Kir2.1所抑制.这些结果表明,Kir2.1通过竞争结合Stk38而抑制Stk38-Smurf1的形成,减少MEKK2的泛素化降解而使其在细胞积累,进而激活MEK1/2-ERK1/2-Snail通路. 4. Kir2.1在胃癌组织中表达的临床病理学意义 (1)胃癌组织较癌旁组织高表达Kir2.1 采用免疫组化染色(immunohistochemistry, IHC)方法检测了349例胃癌组织标本和131例配对的癌旁正常组织中Kir2.1的表达,结果显示Kir2.1在胃癌组织中的表达水平远高于正常组织(p< 0.0001).GEO数据库GES13911和GSE27342的分析也表明,Kir2.1的mRNA表达水平在胃癌组织中高于配对的癌旁正常组织(均p<0.001). (2)Kir2.1的表达水平与临床病例参数 通过SPSS软件绘制ROC曲线分析得到了Kir2.1免疫组化评分(相对光密度)的cut-off值为0.03438,以此将胃癌病人分为Kir2.1高表达(Kir2.1high)和低表达(Kir2.1low)两组.卡方检验发现,Kir2.1的表达水平与胃癌的分化程度(p=0.039)、浸润深度(p= 0.000)、淋巴结转移(p=0.000)和TNM分期(p= 0.000)呈显著正相关,而与病人年龄(p=0.316)和性别(p=0.103)无关. (3)Kir2.1的表达水平和患者预后的关系 Kaplan Meire分析结果显示,Kir2.1的表达水平与患者的总生存期(overall survival, OS)及无进展生存期(progression-free survival, PFS)均呈显著负相关(均p< 0.0001).KMPLOT数据库的分析同样发现,Kir2.1的mRNA表达水平与患者的OS和PFS均呈显著负相关(均p< 0.0001).单因素和多因素的COX回归分析显示,Kir2.1是胃癌患者的独立预后因素(p= 0.000和p= 0.003),提示Kir2.1可以作为评价患者预后的标志物. 结论 1. 侵袭性胃癌细胞高表达功能性Kir2.1. 2. Kir2.1促进胃癌细胞的EMT和侵袭转移不依赖其钾离子通道功能本身. 3. Kir2.1通过与Stk38相互作用,抑制Stk38-Smurf1复合体的形成,减少MEKK2的泛素化降解,因而激活 MEKK2-MEK1/2-ERK1/2-Snail 信号通路,诱导胃癌细胞发生EMT而促进其侵袭转移. 4. Kir2.1在胃癌组织中高表达,其表达水平与胃癌的分化、T分期、淋巴结转移及TNM分期呈显著正相关,与患者的OS和PFS呈负相关,是胃癌患者的独立预后因子.