本论文通过设计和构建短肽-HSA融合蛋白表达载体,表达纯化融合蛋白,体外细胞学及动物体内实验,建立了一个验证模拟多肽作为载体转导蛋白质通过血脑屏障的技术平台,为今后大规模的筛选验证打下基础.同时,我们还对短肽能够在血管内皮细胞上定位的机制进行了初步研究,希望发现脑部血管内皮细胞上新的与血脑屏障有关的标志分子.首先,酵母分泌型表达载体的构建.设计和构建了带有短肽基因插入位点的融合基因序列EcoRI-Kozak-α-factor-(EagI)(XhoI)-HSA-EcoRI,将融合基因用EcoRI酶切后克隆至pAO815的EcoRI位点,得到pAO-HSA.人工合成两个短肽基因,在两端加上EagI和XhoI酶切位点,双酶切后插入pAO-HSA质粒中,得到pAO-7/12-HSA.随后,利用毕赤酵母表达体系完成了重组蛋白的表达、纯化,并得出了重组蛋白稳定表达以及大量纯化的条件.三种重组蛋白的表达量都在10 mg/L左右,能够稳定表达,经过疏水柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析两步纯化后均可得到纯度高于85%的产物.然后,体外培养HUVEC细胞,通过免疫荧光结合流式细胞仪检测短肽-HSA融合蛋白进入血管内皮细胞的能力.结果显示三种重组蛋白均能够进入细胞,而且进入的量相差不多.这说明该细胞能够主动摄取rHSA,很可能细胞表面表达有HSA受体.今后的筛选中以采用脑部血管内皮细胞进行细胞学实验较好.最后,动物体内实验对短肽-HSA融合蛋白能否通过血脑屏障进行了验证.将重组蛋白通过尾静脉注射小鼠,4 hr后麻醉小鼠,取出脑组织进行免疫组化检测.结果显示,与未注射蛋白的阴性对照组相比,注射了rHSA,7-rHSA,和12-rHSA的小鼠脑组织未见到明显差异,在小血管内皮细胞上没有见到着色,脑实质也没有明显着色.今后的实验中将在已建立的技术平台上进行大规模的验证,以期能够筛选到理想的载体.同时,我们还利用酵母双杂交筛选脑cDNA文库,筛选能够与环7肽结合的蛋白编码顺序,对环7肽能够在脑血管内皮细胞上定位的机制进行了初步探讨.结果显示,电压门控钠离子通道蛋白的β亚基能够与环7肽在酵母体内作用.