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目的： 随着胶质瘤与miRNAs的深入研究，发现miR-218和miR-29均是重要的胶质瘤抑瘤微小RNA，其表达异常减少与胶质瘤的发生、发展密切相关。miR-218和miR-29已被证实可通过敲低靶基因抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。人类miR-29家族成员有miR-29a、miR-29b、miR-29c。以往研究显示，在miR-29a基因和miR-29b-1基因的共用启动子区有NF-κB和c-Myc的结合位点，其与NF-κB亚单位及c-Myc结合后可抑制pri-miR-29a和pri-miR29b-1的转录，在miR-29b-2基因和miR-29c基因的共用启动子区有c-Myc的结合位点，其与c-Myc结合后可抑制pri-miR29b-2和pri-miR-29c的转录；而NF-κB是c-Myc的转录激活因子。以上研究提示NF-κB和c-Myc是miR-29s表达的重要负调控因子，NF-κB过度激活可能是导致胶质瘤细胞miR-29s表达异常减少的重要分子机制，细胞中NF-κB/c-Myc通路的活性直接决定着miR-29s的表达水平。亦有研究证明，miR-218是NF-κB的重要活性抑制因子，其可通过沉默表皮生长因子受体共扩增和过表达的蛋白（Epidermal growth factor receptor-coamplified and overexpressed protein，ECOP）表达抑制NF-κB的活性，故推测miR-218是否可通过抑制ECOP/NF-κB/c-Myc通路的活性上调miR-29s的表达。以人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251作为研究对象，明确补充外源性miR-218能否纠正该通路功能异常，以进一步研究miR-218和-29s间是否存在交互调控环路并探索其分子机制，为建立以该通路为核心的胶质瘤基因干预和分子靶向治疗新策略提供客观的参考依据。 方法： 1.以人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251作为研究对象，利用核酸转染技术转染miR-218成熟体的类似物（mimics），同时设置无义序列对照组（Scr group），利用茎环引物荧光实时定量RT-PCR（Stem-loop qRT-PCR）检测转染miR-218对细胞内miR-218表达水平的影响，同时也用qRT-PCR检测转染miR-218对细胞内ECOP和c-Myc mRNA含量的影响，通过Western Blot检测转染miR-218对细胞内ECOP和c-Myc蛋白表达的影响。 2.用miR-218mimics转染人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251，利用免疫荧光标记NF-κB P65和P50亚基，在共聚焦显微镜下观察上述亚基细胞定位的变化，以评价NF-κB的活化状态。 3.将NF-κB的荧光素酶报告基因质粒载体和miR-218mimics共同转染人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251，同时设置Scr、miR-218inhibitor、miR-218inhibitor+NF-κB抑制剂PDTC（Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium）等实验对照组，利用此双荧光素酶报告基因实验检测各组U87MG和U251细胞内NF-κB的活性。 4.用miR-218mimics转染人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251，通过qRT-PCR检测转染miR-218后U87MG和U251细胞内miR-29s(miR-29a/b/c)的表达水平。 5.构建插入miR-29b-1/a启动子区序列的荧光素酶表达载体，转染人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251，设置空白对照、miR-218mimics、NF-κB抑制剂PDTC、miR-218inhibitor、miR-218inhibitor+PDTC各实验组，通过双荧光素酶报告基因实验来测定各实验组miR-29b-1/a启动子的活性。 结果： 1.qRT-PCR检测结果显示，转染miR-218mimics的U87MG和U251细胞组比各自相对应的Scr组miR-218的含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 2.qRT-PCR和Western blot检测结果示，miR-218mimics转染组ECOP mRNA及蛋白表达水平均明显低于无义序列对照组，证实miR-218可以诱导ECOP mRNA的降解并阻断其编码蛋白的表达。 3.U251细胞miR-218mimics转染组c-Myc mRNA含量低于其对照的Scr组，差异有统计学意义（P＜0.05），U87MG细胞miR-218转染组c-Myc mRNA含量相比Scr组稍低，但差异均无统计学意义；U87MG和U251miR-218mimics转染组c-Myc的蛋白表达水平与相应Scr组相比无明显差异。 4.P50和P65的免疫荧光实验结果示：U87和U251细胞系Scr组P50、P65的荧光主要在细胞核，而miR-218组P50、P65的荧光主要在细胞质，可见miR-218可抑制NF-κB P50和P65向核内转移，证实其可抑制NF-κB通路的活性。 5.NF-κB荧光素酶报告基因实验结果显示，转染miR-218mimics的U87MG和U251细胞组荧光素酶的活性比各自相对应的Scr组明显降低，而转染miR-218inhibitor组NF-κB的活性比Scr组有所增高，在miR-218inhibitor的基础上加入NF-κB抑制剂PDTC后NF-κB的活性又复降低（P＜0.01），证实胶质瘤细胞中miR-218可以抑制NF-κB的活性。 6.Stem-loop qRT-PCR检测结果显示，U87MG和U251转染miR-218mimics组miR-29a/c及miR-29b的含量均高于相应Scr组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 7.miR-29b-1/a启动子荧光素酶报告基因实验结果显示，U87MG和U251细胞系miR-218mimics转染组和NF-κB抑制剂PDTC组miR-29b-1/a启动子活性高于空白对照组；miR-218inhibitor转染组miR-29b-1/a启动子活性低于空白对照组，在此基础上加入NF-κB抑制剂PDTC后miR-29b-1/a启动子活性又复增加至高于空白对照组和miR-218mimics转染组的水平。上述各组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。 结论： 1.在胶质瘤细胞中，ECOP是miR-218的天然靶基因。miR-218可通过诱导ECOP mRNA的降解和/或阻断翻译过程抑制其编码蛋白的表达。 2.在胶质瘤细胞中，外源性miR-218mimics可通过敲低胶质瘤细胞中ECOP的表达抑制NF-κB通路的活性，而miR-218抑制剂则可提高NF-κB通路的活性。 3.转染miR-218mimics并未影响U87MG及U251细胞中c-Myc蛋白的表达水平，提示在胶质母细胞瘤中miR-218并非c-Myc表达的关键调控因子，其miR-218表达异常降低并非c-Myc过表达的根本原因。 4.转染外源性miR-218mimics可有效提高胶质母细胞瘤细胞系miR-29a/c及miR-29b的表达水平。 5.在胶质母细胞瘤细胞中miR-218可通过抑制NF-κB通路的活性阻断其对miR-29b-1/a启动子的抑制作用，从而在转录水平提高miR-29的表达水平。 6.鉴于miR-218mimics无法有效提高或降低胶质母细胞瘤细胞c-Myc的表达水平，故后者并未参与miR-218对miR-29表达的调控。