霍乱弧菌(Vibrio cholerae,VC)是水产动物中常见的、危害最大的病原菌之一,不仅可引起鱼类严重的脱黏病和细菌性肠炎,而且还可通过水产品感染人类,引起人类烈性肠道传染病。目前控制该病的主要手段是使用抗菌药物,但是由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加,在很大程度上限制了抗菌药物的疗效。因此,该病免疫防治的研究具有重要意义。鉴于霍乱弧菌通过毒素共调菌毛(toxin-coregulated pilus,Tcp)黏附定植于小肠黏膜是其致病的前提,阻断霍乱弧菌的黏附定植即可防止感染的发生。对此,本研究选择暴露于细菌表面并与霍乱弧菌黏附定植密切相关的黏附素TcpA为目标,通过基因工程技术获得重组蛋白GST-TcpA,研究其免疫保护作用,以确定重组TcpA蛋白在霍乱弧菌基因工程亚单位疫苗研制中的应用价值。首先,应用PCR方法从霍乱弧菌Y1菌株基因组DNA中扩增tcpA结构基因并克隆至pMD18-T载体进行序列测定与分析。序列分析显示tcpA结构基因由675个核苷酸组成,开放阅读框完整无中断,编码由224个氨基酸组成的相对分子量约为21 kD的TcpA蛋白。tcpA结构基因在霍乱弧菌Y1菌株与Genbank中登录的20个霍乱弧菌参考株之间均具有较高的同源性,彼此间的核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别介于71.8%-99.7%和57.7%-99.3%之间。这些研究结果为tcpA基因的亚克隆和表达奠定了基础。其次,将tcpA基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。根据pGEX-4T-1表达载体阅读框的要求,设计1对包含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异引物,以重组克隆质粒pMD-18T-tcpA为模板,扩增tcpA结构基因。PCR产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后,亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。pGEX-4T-1-tcpA/BL21重组菌经IPTG诱导后,可以包涵体形式高效表达分子量约47.0 kD的重组蛋白GST-TcpA,并经提纯后获得大量的该重组蛋白,从而为进一步研究其免疫保护作用奠定了基础。最后,分别采用Western blot、细胞黏附抑制试验和免疫保护性试验测定重组蛋白GST-TcpA的抗原性和体内外免疫保护作用。pGEX-4T-1-tcpA/BL21重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分离后,转移至PVDF膜,以霍乱弧菌菌毛蛋白抗血清为一抗进行Western-blot分析,结果显示重组蛋白GST-TcpA可与菌毛蛋白抗血清发生特异性免疫反应,证实重组TcpA蛋白保持了天然Tcp蛋白的抗原性。以霍乱弧菌菌体、霍乱弧菌菌毛蛋白、重组蛋白GST-TcpA和GST蛋白分别免疫小鼠制备抗血清,检测这四种抗血清在细胞黏附抑制试验中的作用。结果显示菌体抗血清可完全抑制细菌对HEp-2细胞的黏附,菌毛抗血清和重组蛋白抗血清可明显降低细菌对HEp-2细胞的黏附,而GST抗血清无黏附抑制作用。表明重组蛋白抗血清在体外能明显抑制霍乱弧菌Y1菌株对HEp-2细胞的黏附作用,除Tcp外,霍乱弧菌Y1菌株尚表达其它黏附素。实验小鼠分别经纯化重组蛋白GST-TcpA和GST蛋白四次免疫后,用Y1株菌液进行攻击,结果显示重组蛋白免疫组小鼠的免疫保护率为81.25%,而GST免疫组小鼠和生理盐水对照组小鼠全部死亡。说明重组TcpA蛋白对霍乱弧菌感染具有较好的免疫保护作用。综上所述,本研究在成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-tcpA并获得重组蛋白GST-TcpA的基础上,探明了重组TcpA蛋白仍保留了天然Tcp蛋白的抗原性和免疫保护作用,在霍乱弧菌基因工程疫苗的研制中具有潜在的应用价值。