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[目的]胶质母细胞瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。尽管成像技术和多模式的治疗方案有了长足发展,但总的来说,多形性胶质母细胞瘤患者预后很不乐观。即使给予最为充分的治疗,患者的平均存活期中位数只有12-18周,而那些没有进行干预治疗的患者多在诊断后不久死亡。胶质母细胞瘤预后不良主要是由于极高的复发倾向。有人认为,胶质母细胞瘤在生存到32-36周复发几乎不可避免。P75神经营养因子受体(P75neurotrophin receptor, P75NTR)是近年来新发现的一种促进胶质母细胞瘤增殖,抑制凋亡的相关基因。本研究利用RNA干扰(RNA interfere, RNAi)技术沉默P75NTR在胶质母细胞瘤系U251中的表达,观察其促进胶质母细胞瘤凋亡的治疗效果,为胶质母细胞瘤的基因治疗提供新的方法选择。[方法]①U251胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,每3d传代1次。取生长状态良好的U251胶质瘤细胞,实验前24h换液备用。实验共分为5组。对照组：常规培养的U251胶质瘤细胞；空载组：转染空载质粒的U251胶质瘤细胞；siRNA1-3组：分别转染序列(1)-(3)的U251胶质瘤细胞。②RT-PCR方法检测P75NTR的mRNA表达以确定基因沉默效果：利用Primer Premier5.0软件设计相关引物,P75NTR引物序列为：上游5’-CGTATTCCGACGAGGCCAACC-3’,下游5’-CCACAAGGCCGACAACCACAGG-3’,产物大小为286bp；GAPDH引物序列为：上游5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTAT-3’,下游5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA C-3’,产物大小为598bp。③绘制细胞生长曲线：将获得最佳基因沉默效果的稳定基因转染的U251细胞作为RNAi组置于细胞培养箱中培养。于培养第24、48、72、96、120、144h行细胞计数,绘制细胞生长曲线。④原位细胞凋亡实验检测细胞凋亡情况⑤Western blot方法检测稳定转染后第3天时P75NTR、促凋亡基因Caspase-3和凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达。[结果]①RT-PCR检测结果空载组及对照组U251胶质瘤细胞系均高表达mRNA,转染siRNA质粒后U251细胞P75NTR的mRNA表达水平显著下降。②细胞生长曲线对照组和空载组细胞增殖旺盛,RNAi组细胞增殖速度在几个检测时间点均明显低于对照组和空载组,即细胞增殖能力下降。③TUNEL细胞凋亡检测结果转染48h后可见对照组和空载组几乎没有凋亡细胞(红色细胞核为阳性),但在RNAi组细胞凋亡数量明显增加。④Western blot结果与对照组和空载组比较,P75NTR与Bcl-2在RNAi组蛋白表达水平显著降低,Caspase-3则明显升高。[结论]①本研究通过绘制细胞生长曲线发现,有效的RNAi转染可明显降低细胞增殖速度,细胞凋亡检测发现经稳定基因转染的U251细胞凋亡数量明显增加。通过Western Blot方法验证了促凋亡基因Caspase-3和凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达,发现促凋亡基因Caspase-3的表达明显增加,而凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达水平显著下降。②本研究提示靶向沉默U251胶质母细胞瘤细胞中P75NTR基因表达后,可能通过直接或间接机制诱导促凋亡基因Caspase-3的过表达,同时抑制凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达,在细胞凋亡通路水平共同调控诱导肿瘤细胞的凋亡进程。③本研究在细胞水平发现并验证了3个靶向沉默P75NTR的RNAi片段可有效沉默凋亡抑制基因P75NTR的mRNA和蛋白表达,诱导U251胶质母细胞瘤细胞发生细胞凋亡,为未来胶质母细胞瘤的分子治疗提供了新的基因靶点选择。