【摘 要】
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光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科（Tenebrionidae）昆虫,它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间的低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存。为了探明光滑鳖甲对长时间的低温和剧烈的温度变化等逆境的适应机制,本论文研究了光滑鳖甲不同发育阶段抗冻蛋白基因在mRNA水平有何变化规律;环境低温对不同发育阶段抗冻蛋白基因表达的影响;探讨光滑鳖甲抗冻蛋白基因季节性表达规律以及各种环境因子对光滑
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光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科（Tenebrionidae）昆虫,它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间的低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存。为了探明光滑鳖甲对长时间的低温和剧烈的温度变化等逆境的适应机制,本论文研究了光滑鳖甲不同发育阶段抗冻蛋白基因在mRNA水平有何变化规律;环境低温对不同发育阶段抗冻蛋白基因表达的影响;探讨光滑鳖甲抗冻蛋白基因季节性表达规律以及各种环境因子对光滑鳖甲抗冻蛋白基因转录和表达的影响;同时还对光滑鳖甲天然抗冻蛋白进行了分离纯化的初探,实验结果如下。通过对光滑鳖甲幼虫在不同发育阶段抗冻蛋白水平变化的研究发现,随着幼虫龄期的增大,Apafps mRNA水平逐渐增加,至8-9龄幼虫阶段达到最高约为小龄幼虫的7-8倍,蛹期时则显著降低。体液的渗透浓度值也呈现相同趋势。说明发育阶段的变化是对光滑鳖甲抗冻蛋白基因表达的重要调节因素。在低温胁迫下4-6龄幼虫AFPs的表达显著提高,说明冷胁迫能促进幼虫AFPs的累积。这表明抗冻蛋白基因表达存在发育阶段差异性。环境低温对光滑鳖甲幼虫抗冻蛋白基因表达也有一定程度的影响,同时在低温下不同龄期幼虫的存活率也有区别,小龄期幼虫（1-3龄）,存活率为64%;中龄期幼虫（4-6龄）,存活率为77.8%;大龄期幼虫（7-9龄）存活率为100%,蛹的存活率为100%。结合Apafps基因表达、低温存活率和野外采集时观察的结果可以推测光滑鳖甲大龄幼虫可能是一种过冬虫态。光滑鳖甲成虫抗冻蛋白基因Apafp914和Apafp752季节性表达规律的总趋势相似,即低温的季节表达量较高,而在温度较高的季节表达量低。但是,Apafp752在最为炎热的6月和7月表达量显著地高于其5月份的, Apafp914在6月和7月的表达量也显著地高于其8月份的。并且Apafp752在全年的表达量都高于Apafp914,在温度最低的3月,Apafp752的表达量是Apafp914的3.5倍。THA的变化与转录水平的变化相同。低温处理结果表明Apafp752和Apafp914受到低温诱导,转录水平随处理时间的延长呈正相关增加。低温短时间处理的结果显示两基因同在处理16小时后开始显著增加,且Apafp752对于低温的响应比Apafp914早,经过24小时的处理后转录达到峰值,并保持2-3天。低温长时间处理的结果表明3天后两种基因的转录比较对照组显著地增加,并在9-12天时达到峰值,同样Apafp752对于低温的响应要强于Apafp914。温度周期处理的结果表明Apafp752和Apafp914的mRNA水平与对照组相比都有显著提高。Apafp752在处理一到两个周期后与对照组相比提高了5.2倍和7.7倍,而Apafp914则只提高了2.3和4.5倍。当处理两个周期过后,两种基因的mRNA水平均有所下降,而且温度的波动也能有效提高体液的THA （F4,10=11.48,P<0.0001）,并且THA增加滞后于mRNA水平的增加。这说明抗冻蛋白可能在春秋温度变化较大的环境下对昆虫起重要的保护作用。干旱处理结果表明处理3天后Apafp752和Apafp914的mRNA水平与对照组相比都有显著提高。（Apafp752 F3,8=65.37, P<0.0001; Apafp914 F3,12=18.54, P<0.0001）。并且两种基因mRNA的积累在处理3天时比低温处理3天更高,Apafp752和Apafp914在处理三天后与对照组相比分别提高了4.4倍和2.2倍。并且在干旱处理下两基因的表达差异要小于在低温处理条件下的差异。这可能说明两基因对冷和干旱的响应机制是不相同的。干旱同样可以有效提高光滑鳖甲体液的THA,并在3天时THA开始显著增加（F3,8 =27.13, P=0.0002）,在六天时达到最大值。通过提取光滑鳖甲体液,使用热处理和阳离子交换的方法对天然抗冻蛋白进行了分离纯化,并对分离产物透析,冷冻干燥浓缩后进行渗透浓度的测定。结果成功的分离出4个具有活性的吸收峰。成功分离纯化天然抗冻蛋白将为深入开展天然抗冻蛋白结构特点及功能特性的研究提供条件。
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