乙酰乳酸合酶(acetohydroxyacid synthase, AHAS)是硫胺素焦磷酸(ThDP)依赖酶的一种,催化亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)等支链氨基酸生物合成途径的关键步骤。当底物为单一丙酮酸时,在乙酰乳酸合酶的催化下,两分子丙酮酸缩合生成乙酰乳酸,但是该酶很不稳定,容易失活,这就阻碍了将AHAS作为靶标筛选其抑制剂工作的顺利开展。因此,研究大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及活性分析有很重要的实际意义。大肠杆菌同工酶AHAS Ⅰ有独特的催化和调节性能,不仅产生乙酰乳酸的活性最强,而且对2-丁酮酸作为第二个底物的偏好性很低,所以本文主要以AHAS Ⅰ为研究对象,对酶的制备及活性分析进行了研究,主要过程和结论如下：首先,利用PCR的方法,扩增出编码AHAS Ⅰ的基因ilvB,将其克隆入pPROEX HTb载体中,构建pPROEX HTb-AHAS重组质粒。将此重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中,构建BL21(DE3)-pPROEX HTb-AHAS工程菌,并对其进行酶切验证,测序。其次,将完全正确的重组蛋白用0.5mM IPTG诱导,30℃培养8h后,所得产物用SDS-PAGE电泳分析。结果表明,大约在66kDa处出现一条目的条带。最终所得蛋白浓度为5mg/mL,产率为50mg/L。进一步,分别检测了粗酶和纯化后酶的活性,优化了反应条件,研究了影响酶稳定性的因素。结果表明：粗酶有很好的活性,纯化后酶的活性较弱,因此选择粗酶作为研究对象。最佳反应条件如下：最佳反应时间为1h,最适温度为37℃,反应体系最适pH值为7.0左右,反应最佳酶浓度为3μg/μL,粗酶的总体转化率在35%左右。同时我们发现在裂解缓冲液中加入甘油及将乙酰乳酸合酶冷冻干燥能增加其稳定性。