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本研究以桑蚕茧壳为原料,将其浸泡、除杂后,按1∶50(w/v)的比例加入0.5%Na2CO3溶液,煮沸60min脱胶。以1∶10(w/v)的比例加入到50%CaCl2溶液中,煮沸溶解丝素,经超滤脱盐后制得丝素蛋白溶液。通过六种酶对家蚕丝素蛋白水解的试验表明,Alcalase2.4L水解效果最佳,复合风味蛋白酶Flavorzyme次之,由正交表极差分析结果可知,单酶水解(1)碱性蛋白酶Alcalase2.4L水解丝素蛋白的最佳作用条件是:8%的丝素溶液中加入1%的酶,在pH值为8,55℃条件下反应6h,水解度可达到39.34%,氨基氮含量为3.43g/l,多肽含量为53.68g/l,回收率为76%;(2)Flavorzyme水解丝素蛋白的最佳作用条件是:在pH值7、酶浓度6%、底物浓度8%、反应时间3h、50℃的条件下,水解度可达38.31%,氨基氮含量为2.86g/l,多肽含量为46.39g/l,回收率为80%。
通过酶解工艺的优化,采用双酶水解时,先以碱性蛋白酶Alcalase2.4L确定的最佳作用条件水解后,再用Flavorzyme继续水解丝素蛋白,在pH值7的条件下,酶浓度2%,底物浓度8%,反应时间3h,温度50℃,是其最佳水解工艺。在此作用条件下,水解度可达44.13%,氨基氮含量为5.73g/l,多肽含量为66.8g/l,其回收率为69%。SDS-PAGE电泳检测证明,双酶水解后,水解产物的分子量由经CaCl2处理后的大约65KDa降到10KDa以下。
双酶水解后制得的丝素肽通过SephadexG-25和DEAE-52柱层析纯化后,经毛细管电泳鉴定其得到了纯化;分别采用NBT光还原法、D2-脱氧核糖法和体外动物实验模型研究了丝素肽的抗氧化作用,结果表明:丝素肽对超氧阴离子自由基和羟基自由基有很强的清除作用,清除率分别为65.7%和65.2%,并且能显著地抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血反应的发生。氨基酸分析结果表明,丝素抗氧化肽由12种氨基酸组成,约占氨基酸总含量的21%,含有4种人体必需氨基酸(Val、Ile、Leu、Lys)。