次声(infrasound)是由物体(物质)的机械性振动所产生,频率为0.0001～20Hz的声波,具有穿透性强、传播距离远和衰减慢等特点。广泛存在于自然界和人工环境中,包括海潮、地震、海啸、大型机械和火箭发射等。尽管人耳不能听到次声,但是实验研究发现高强度次声可以对人体和多种动物中枢神经系统产生明显的损伤,包括下丘脑、皮层和皮层下广泛区域等。随着现代工业和运输业的发展,次声在噪音污染中扮演了重要的角色。有研究表明:次声损伤CNS的机制之一就是引起炎症反应,但是关于次声引起中枢神经系统炎症的具体机制仍然知之甚少。MI作为中枢神经系统内的免疫细胞,在炎症过程中发挥重要作用,因此对它的研究就显得尤为重要。MI在中枢神经系统损伤时会很快地向损害区域移动,一方面保护中枢神经系统,限制和清除外来微生物,吞噬和消除有害物质和坏死的大脑碎片;另一方面MI可以产生多种细胞因子,并参与抗原呈递过程,构成脑内的免疫系统,参与了多种疾病的发生、发展和转归的过程。它们或发挥保护性作用,使疾病转归痊愈;或引起疾病的迁延,加重疾病的损伤使得疾病恶化。我们实验室前期的工作已经发现次声可以明显活化脑内的MI。有研究证明,活化的MI对神经元来说是一把双刃剑,既引起神经元的损伤,也可对损伤的神经元起到保护性作用。但是次声作用后的小胶质细胞具体会发生什么变化以及在次声损伤过程中的确切作用仍不明了。我们通过利用16Hz130dB高强度次声作用于体外培养的大鼠MI,并设计以下实验对上述两个问题进行了初步的探讨。实验一体外培养小胶质细胞对次声的反应。实验二次声活化的小角质细胞上清液对神经元的影响。实验三体外模拟次声活化的小胶质细胞分泌的TNF-α,IL-1β等对神经元的损伤试验以及TNF-α,IL-1β等细胞因子的中和性抗体的保护神经元的作用。实验四次声作用后的小胶质细胞和星形胶质细胞分泌几种细胞因子的变化情况。实验结果如下:实验一体外培养小胶质细胞对次声的反应。(1)细胞改变:正常的MI胞体较小,胞浆少,圆而突起少。次声后即刻见MI胞体变大。次声后4h阿米巴样细胞增多,细胞分裂活跃。次声12h后MI肿胀更明显,胞浆内空泡增多。次声24h后MI胞浆更丰富,双核细胞更多。(2)细胞因子变化:在次声作用30min后即刻MI上清液中的IL-10就开始升高,到12h达到高峰。TNF-α和IL-1β的表达则是在次声作用后4h即开始升高到12h升高至峰值,然后降低。在次声作用1h后,MI培养液中炎性因子TNF-α与IL-1β含量在24h内呈持续性升高,而两者的分泌并不同步。IL-1β的升高在作用后即刻就明显升高;而TNF-α一直到作用后12h才见明显升高,明显滞后于IL-1β的分泌。而保护性因子IL-10在4h和24h出现双峰值,并且各观察点数值与对照组相比均明显升高。实验二次声活化的小角质细胞上清液对神经元的影响。次声作用30min和1h后不同时间点收集的MI上清对神经元的影响:(a)MTT结果:次声暴露30min后的MI在各时间点收集的上清液对原代培养的大鼠神经元细胞不会产生损伤作用;次声作用1h后的MI各时间点收集的上清液对原代培养的大鼠神经元细胞均会产生明显的损伤作用。(b)TUNEL检测凋亡结果:次声暴露30min后各时间点收集的MI上清液对原代培养的大鼠神经元细胞不会产生促凋亡的作用;次声暴露1h后各时间点收集的MI上清液对原代培养的大鼠神经元细胞均会产生明显的促凋亡作用。且次声作用1h后24h时间点收集的MI上清液引起神经元的凋亡最明显。实验三体外模拟次声活化的小胶质细胞分泌的TNF-α,IL-1β等对神经元的损伤试验以及TNF-α,IL-1β等细胞因子的中和性抗体的保护作用。(1)次声作用1h后的MI分泌的TNF-α,IL-1β等对神经元的模拟损伤试验以及TNF-α,IL-1β等细胞因子的中和性抗体的保护神经元的作用。流式细胞仪检测结果:次声1h后,MI分泌的TNF-α,IL-1β模拟损伤神经元细胞的凋亡率平均分别为443.2%和57±4.8%,而两者共同作用引起的凋亡率平均是67.5±6.4%;而5μg/ml的TNF-α,IL-1β等细胞因子的中和性抗体可以完全中和掉次声后小胶质细胞分泌的TNF-α,IL-1β的生物学活性,且应用5μg/ml的TNF-α,IL-1β等细胞因子的中和性抗体的浓度不会影响神经元细胞的状态。(2)在次声作用1h后24h时间点收集的MI上清液中分别加入TNF-αIL-1β和TNF-α/IL-1β的中和性抗体后,一定量置换大鼠神经元细胞培养液后48h后对神经元的影响:(a)流式细胞仪检测凋亡结果:加入IL-1β和TNF-α/IL-1β中和性抗体的两组与对照组(24h时间点组)和单纯加入TNF-α中和性抗体组之间均有明显的统计学差异;而单纯加入TNF-α中和性抗体组与对照组无明显统计学差异。实验四次声作用后的小胶质细胞和星形胶质细胞分泌几种细胞因子的变化情况。(1)星形胶质细胞改变:可见正常对照组星形胶质细胞为形状不规则,胞浆丰富且核浆比较少,胞体分支多,细胞核为椭圆形,常偏于胞体一侧的星形胶质细胞。次声作用1h后的星形胶质细胞从显微镜下见变化在24h内细胞变化不明显。MI改变如实验一,由静息状态明显地转变为活化状态。(2)星形胶质细胞上清液中细胞因子的变化:在次声作用1h后的星形胶质细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-10等细胞因子均可见在24h后才轻微升高。而MI上清液中多种细胞因子在次声后4h内就可见明显的升高。本实验结论如下:(1)结合以前工作基础,进一步证实暴露于16Hz 130dB次声后,大鼠小胶质细胞可明显从静息转变成活化状态,并且这种反应要早于星形胶质细胞。因此,小胶质细胞可能是中枢神经系统内对次声反应最早的细胞。(2)16Hz 130dB次声30min活化的小胶质细胞,其分泌的细胞因子不会对对神经元产生损伤作用;16Hz 130dB次声1h活化的小胶质细胞在4h,12h和24h时间点的上清液均会对神经元产生损伤作用,主要是引起神经元的凋亡,其中24h时间点产生的凋亡作用最明显。(3)暴露于16Hz 130dB次声1h活化的小胶质细胞主要是通过促炎性细胞因子来引起神经元的凋亡,其中在前24h内可能主要是通过分泌IL-1β来引起神经元的凋亡;而在前24h内TNF-α可能不发挥主要作用。