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氯酚类化合物(Chlorophenols,CPs)是环境中常见的一类持久性有机污染物,具有结构稳定且致癌、致畸、致突变的“三致”性质。由于其在环境中很难被降解,而且具有生物积累性和远距离迁移性,对生物体和生态环境都有很大的危害,早在上个世纪就被世界各国列入了优先污染物清单。目前国内对于CPs的修复方法大多为物理化学修复,但是这些技术本身存在一定的缺陷,而生物修复中的转基因植物修复技术,因其具有低成本、环境友好、永久高效等特点,成为了最具应用前景的一种环境修复技术。因此,本研究选择多年生、深根系植物紫花苜蓿为材料,将2,4-二氯苯酚羟化酶(TfdB)基因转入苜蓿体内,以提升植物对CPs的耐受性和生物可利用性。(1)将已经构建的植物表达载体pCAMBIA3300N+TfdB,使用农杆菌介导法转入野生型苜蓿植株,用草铵膦(Basta)进行抗性筛选,最终获得了30株转化株系。(2)提取转TfdB基因苜蓿DNA,通过PCR检测发现目的基因已经转入苜蓿株系中。提取阳性植株总蛋白进行ELISA检测,结果表明TfdB基因能够在转基因植株中表达,且蛋白含量各不相同。对各个阳性株系进行酶活分析,结果表明不同株系酶活性不同,其中野生型苜蓿酶活性为0.0078 U/mg,转基因植株的酶活范围为0.0084-0.0499 U/mg。选取酶活性最高T13株系(0.0499 U/mg)进行扦插扩繁以备后续使用。(3)利用水培法研究转TfdB苜蓿和拟南芥对2,4-DCP和2,4,6-TCP的修复效能。结果显示,转TfdB植株和野生型植株对2,4-DCP和2,4,6-TCP的耐受性和去除率均有显著性差异。当2,4-DCP浓度为40 mg/L时,转TfdB苜蓿对2,4-DCP的去除率约为野生型苜蓿的1.8倍,耐受指数为76.92%,与野生型苜蓿(-9.09%)相比,提高了86.01%;当2,4-DCP浓度分别为10 mg/L和30 mg/L时,转TfdB拟南芥对2,4-DCP的去除率分别约为野生型拟南芥的0.98倍和1.9倍,其耐受指数分别为-9.68%和-22.58%,与野生型拟南芥(-105.26%和-89.47%)相比分别提高了95.58%和66.89%。在2,4,6-TCP浓度为30 mg/L的培养液中,转TfdB苜蓿对2,4,6-TCP的去除率约为野生型苜蓿的1.5倍,其对2,4,6-TCP的耐受指数为-8.33%,与野生型苜蓿(-27.27%)相比,提高了18.94%;当2,4,6-TCP浓度分别为10 mg/L和20 mg/L时,转TfdB拟南芥对2,4,6-TCP的去除率分别约为野生型拟南芥的1.4倍和2.3倍,其对2,4,6-TCP的耐受指数分别为7.89%和-23.68%,与野生型苜蓿(-23.68%和-50.00%)相比,分别提高了31.57%和26.32%。实验结果说明,2,4-二氯苯酚羟化酶(TfdB)基因可以有效提高植株对2,4-DCP和2,4,6-TCP的耐受性和生物可利用性,从而显著提高转TfdB基因植株对2,4-DCP和2,4,6-TCP的去除率。