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5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase,简称EPSP合酶)，是莽草酸途径中的第六位酶，参与合成芳香族氨基酸以及部分次生代谢产物，同时EPSP合酶不仅是除草剂草甘膦、抗菌素、抗寄生虫药物的作用靶酶，而且也是促进生物体内莽草酸积累的重要调控位点。近年来，随着分子生物学技术的快速发展和对EPSP合酶的深入研究，EPSP合酶基因在耐草甘膦转基因作物、医药卫生等方面被广泛应用。本文主要应用分子对接软件Autodock4.2对大肠杆菌、CP4农杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、霍乱弧菌以及贝氏柯克斯体EPSP合酶·S3P的复合物与草甘膦和底物PEP进行了分子对接研究，结果表明：草甘膦及底物PEP的最佳对接构象都出现在EPSP合酶两个结构域的裂缝处，并靠近S3P；草甘膦及底物PEP与EPSP合酶的结合位点基本一致，同时推测出酶与草甘膦及底物PEP结合的主要推动力为氢键作用、疏水作用以及静电作用；上述六种EPSP合酶与PEP的结合自由能分别为-6.04kcal·mol-1、-6.29kcal·mol-1、-6.10kcal·mol-1、-6.48kcal·mol-1、-6.23kcal·mol-1、-6.11kcal·mol-1，其对应的结合常数Km值分别为37.48μmol、24.36μmol、34.05μmol、17.89μmol、26.93μmol、33.15μmol，根据结合自由能及Km值预测六种EPSP合酶对PEP的催化活性从高到低依次为：结核分枝杆菌、CP4农杆菌、霍乱弧菌、贝氏柯克斯体、肺炎链球菌、大肠杆菌；该六种EPSP合酶与草甘膦的结合自由能分别为-7.30kcal·mol-1、-6.66kcal·mol-1、-6.93kcal·mol-1、-6.73kcal·mol-1、-6.91kcal·mol-1、-6.80kcal·mol-1，其对应的抑制常数Ki值分别为4.47μmol、13.22μmol、8.26μmol、11.73μmol、8.60μmol、10.32μmol，Km/Ki值分别为8.38、1.84、4.12、1.53、3.13、3.21，根据Km/Ki值预测六种EPSP合酶对草甘膦的抗性从强到弱依次为结核分枝杆菌、CP4农杆菌、霍乱弧菌、贝氏柯克斯体、肺炎链球菌、大肠杆菌。在植物和细菌体内，由于Gly是EPSP合酶活性位点处高度保守的氨基酸，而在CP4农杆菌EPSP合酶中，此活性位点处的Gly已被替换为Ala，所以本研究在分子对接所用受体EPSP合酶的晶体结构基础上，采用Pymol软件分别将大肠杆菌EPSP合酶Gly96Ala、CP4农杆菌EPSP合酶Ala100Gly、肺炎链球菌EPSP合酶Gly92Ala、结核分枝杆菌EPSP合酶Gly96Ala、霍乱弧菌EPSP合酶Gly96Ala以及贝氏柯克斯体EPSP合酶Gly95Ala进行单点模拟突变，通过突变产生新的受体与草甘膦及底物PEP进行分子对接研究，结果表明：突变前后草甘膦及底物PEP最佳对接构象所在的位置和结合位点基本一致，促进EPSP合酶突变体与草甘膦及底物PEP结合的主要推动力仍为氢键作用、疏水作用和静电作用；上述六种EPSP合酶突变体与PEP的结合自由能分别为-5.85kcal·mol-1、-6.31kcal·mol-1、-5.99kcal·mol-1、-6.36kcal·mol-1、-6.17kcal·mol-1、-6.00kcal·mol-1，其对应的结合常数Km值分别为51.30μmol、23.53μmol、40.94μmol、21.91μmol、29.85μmol、40.31μmol，根据结合自由能及Km值预测六种EPSP合酶突变体对PEP的催化活性从高到低依次为：结核分枝杆菌、CP4农杆菌、霍乱弧菌、贝氏柯克斯体、肺炎链球菌、大肠杆菌，与未突变EPSP合酶的催化活性顺序相一致，其中仅有CP4农杆菌EPSP合酶突变体对PEP的催化活性提高，其余均降低；该六种EPSP合酶突变体与草甘膦的结合自由能分别为-6.94kcal·mol-1、-7.22kcal·mol-1、-6.72kcal·mol-1、-6.50kcal·mol-1、-6.62kcal·mol-1、-6.49kcal·mol-1，其对应的抑制常数Ki值分别为8.15μmol、5.06μmol、11.88μmol、17.34μmol、13.93μmol、17.55μmol，Km/Ki值分别为6.29、4.65、3.45、1.26、2.14、2.30，根据Km/Ki值预测六种EPSP合酶突变体对草甘膦的抗性从强到弱依次为：结核分枝杆菌、霍乱弧菌、贝氏柯克斯体、肺炎链球菌、CP4农杆菌、大肠杆菌，而与未突变相比，除了CP4农杆菌EPSP合酶突变体对草甘膦的抗性减弱，其它都是增强的，从而推测出活性位点Ala对六种EPSP合酶产生草甘膦抗性具有重要影响。