我们以往的研究表明,严重烧伤后早期（在因毛细血管通透性增加导致有效循环血容量显著减少之前）即出现的心肌损害及心脏泵血功能减弱,不仅引起心功能不全,还可诱发或加重休克,成为烧伤早期缺血缺氧的重要启动因素之一。根据这一认识,提出了烧伤早期缺血缺氧损害的“休克心”假说。因此,防治烧伤后“休克心”对减轻严重烧伤早期缺血缺氧损害具有重要临床意义,但目前尚缺乏有效措施。缺血缺氧时心肌细胞内活性氧（ROS）蓄积所致的氧化损伤是心肌损伤的重要原因。清除ROS可以有效减轻心肌细胞损伤,是防治缺血缺氧心肌损害的一个重要方向。黄芪的主要化学成分有皂甙、黄酮、多糖、微量元素,以及氨基酸、亚油酸等。它对缺血缺氧心肌具有保护作用,作用机制不甚清楚,限制了对它的深入研究和推广应用。黄芪甲苷是一种从黄芪中提取的皂甙类化合物,《中国药典》中以其作为判断黄芪及其制品,如黄芪口服液的质量标准。槲皮素是黄芪黄酮类化合物中含量较高的一种。这两种单体清除ROS,减轻其他疾病导致的心肌氧化损伤的作用均已见报道,但对烧伤早期缺氧心肌细胞氧化损伤的保护作用,以及是否通过调控内源性保护机制减轻缺氧心肌细胞氧化损伤,还缺乏研究。一、研究目的:本研究选取这两种具有代表性的黄芪单体,旨在观察比较它们对缺氧心肌细胞氧化损伤的作用并确定其量效关系;选择效果较好的一种单体和剂量,深入探讨其除ROS的机制,明确黄芪甲苷是否通过调控内源性抗氧化机制减轻缺氧心肌细胞氧化损伤,为临床防治烧伤后“休克心”提供新的思路和实验依据。二、材料方法:1.分离培养SD乳鼠心肌细胞,在94%N₂、5%CO₂、1% O₂的混合气体中培养,制作缺氧模型,缺氧时间为12h。2.将细胞随机分为常氧组（A组）、单纯缺氧组（B组）、缺氧+槲皮素组（C组,C₁组100 mg/L、C₂组50 mg/L、C₃组25 mg/L）、缺氧+黄芪甲苷组（D组,D₁组50mg/L、D₂组25 mg/L、D₃组12.5 mg/L）,缺氧+维生素E组（E组10 mg/L）。槲皮素、黄芪甲苷浓度根据已有文献和预实验确定。3.每组设3个复孔,重复3次,检测常氧、缺氧和缺氧条件下黄芪单体作用前后各组心肌细胞活力（CCK-8）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）的含量;根据检测结果,槲皮素、黄芪甲苷组分别选择一种剂量,检测其作用前后缺氧细胞内ROS浓度的变化。4.根据以上实验结果,挑选黄芪甲苷（25mg/L）进一步研究其清除ROS的机制。5.利用化合反应使FITC或HRP与黄芪甲苷分子连接,以达到标记和示踪黄芪甲苷分子的目的。在荧光倒置显微镜、激光共聚焦显微镜或透射电子显微镜下观察标记后的黄芪甲苷分子入胞和胞内分布情况。6.试剂盒检测黄芪甲苷在体外自由基生成体系中清除羟自由基（OH^-）、超氧阴离子（O₂^-）的能力。7.用SOD阻断剂DDC阻断内源性SOD活性后,检测黄芪甲苷清除缺氧心肌细胞内ROS的能力的变化情况。8.采用逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR）法检测常氧和缺氧（缺氧时间为12h或3h）情况下黄芪甲苷作用前后心肌细胞SOD-1 mRNA表达量的变化。9.采用免疫蛋白质印迹（Western blotting）法检测常氧和缺氧（缺氧时间为12h）情况下黄芪甲苷作用前后心肌细胞SOD-1蛋白表达量的变化。10.所有数据以均数±标准差表示,实验结果采用SPSS11.0统计学软件进行单因素方差分析One-Way ANOVA或均值t检验,P<0.05为差异显著,P<0.01为非常显著。三、主要结果1.单纯缺氧组培养液中LDH、MDA浓度和细胞中的ROS浓度较常氧组明显升高,细胞活力、SOD活性下降。缺氧+槲皮素（25¹00 mg/L）组、缺氧+黄芪甲苷（12.5⁵0 mg/L）组、缺氧+维生素E（10mg/L）组培养液中LDH、MDA浓度和细胞中ROS浓度较单纯缺氧组下降,细胞活力、SOD活性回升。黄芪甲苷、槲皮素的中剂量和大剂量组（C₁-2、D₁-2）改善各个指标的作用均优于黄芪甲苷、槲皮素低剂量组（C₃、D₃）和维生素E（10mg/L）组。同等剂量（C₁与D₁,C₂与D₂）相比,黄芪甲苷组降低LDH浓度和提高细胞活力的作用优于槲皮素组,但二者降低MDA、ROS浓度、提高SOD活性的作用无显著差异。2.合成并提纯了黄芪甲苷-BSA-FITC和黄芪甲苷-BSA-HRP化合物。分别在495nm（FITC在此处有特征吸收率）、403nm（HRP在此处有特征吸收率）处测吸光度,根据标准曲线确定化合物中FITC、HRP浓度,结果如下:FITC:7.2mg/L,HRP:44mg/L。3.荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下观察黄芪甲苷-BSA-FITC胞内分布情况,可见心肌细胞胞浆中有弥散的绿色荧光,分布不均,胞核中无荧光分布;透射电镜下观察黄芪甲苷-BSA-HRP分布情况,可见高电子密度的黑褐色粗大颗粒分布于线粒体膜上,其余细胞器和阴性对照细胞未见高电子密度颗粒分布。4.体外自由基生成体系中,黄芪甲苷在12.5-100 mg/L浓度范围内对OH^-具有显著清除能力,且随剂量升高清除能力增强;黄芪甲苷对O₂^-无显著清除能力。5.黄芪甲苷（25mg/L）能显著降低缺氧后心肌细胞内ROS浓度;SOD阻断剂DDC（50uM）作用后,黄芪甲苷清除ROS的效应基本消失。6.常氧和缺氧（缺氧时间为12h或3h）条件下黄芪甲苷处理后心肌细胞SOD-1 mRNA表达量较前均有所增高。缺氧12h和缺氧3h变化趋势一致。7.常氧和缺氧（缺氧时间为12h ）条件下黄芪甲苷处理后心肌细胞SOD-1蛋白量表达较前均有增高。四、讨论与结论1.槲皮素（25¹00 mg/L）、黄芪甲苷（12.5⁵0 mg/L）能有效清除细胞内ROS、提高SOD活性、减轻细胞氧化损伤、提高细胞活力。其中大、中剂量的槲皮素（50、100mg/L）和黄芪甲苷（25、50mg/L）对缺氧心肌细胞的保护作用优于小剂量的槲皮素（25mg/L）、黄芪甲苷（12.5mg/L）和维生素E（10mg/L）。2.同等剂量下,黄芪甲苷（25、50mg/L）减轻细胞损伤、保护细胞活力的作用较槲皮素（50、100mg/L）更好,但二者在减轻细胞脂质过氧化损伤、提高SOD活力和清除ROS的作用上无显著差异。3.FITC标记的黄芪甲苷分子主要分布在胞浆中;HRP标记的黄芪甲苷分子特异性地分布在线粒体膜上,在细胞膜和其他细胞器中未见分布。4.在常氧和缺氧条件下,黄芪甲苷均能增加心肌细胞SOD-1 mRNA和蛋白表达量,从而加快胞内O₂^-歧化为H₂O₂和OH^-的过程。进入细胞的黄芪甲苷又可以与OH^-发生反应清除部分OH^-,减少细胞内ROS的蓄积,减轻细胞膜、蛋白质、核酸等的氧化损伤,使SOD等细胞内源性抗氧化酶活性得以稳定和提高,细胞内源性保护作用加强。5.黄芪甲苷不能直接清除细胞内的O₂^-,它对ROS的清除作用是通过上调SOD-1表达量和清除SOD歧化产物OH^-实现的,阻断内源性SOD活性后,黄芪甲苷清除ROS的能力基本消失。