流行病学调查表明,肥胖(obesity)与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),糖尿病(diabetes),高血压(hypertension),心脏病(cardiopathy)的发生相关。脂肪组织(adipose tissue)过量积聚脂肪,肌肉组织(muscle tissue)减少脂肪氧化均会导致肥胖。肥胖通常会引起脂代谢紊乱,如高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)。调节体内甘油三酯(triglyceride,TG)的代谢,可以抑制肥胖,改善高甘油三酯血症。　　 有诸多因素影响体内TG的代谢,如食物摄入TG量以及TG在各组织中的氧化分解和合成。在这些因素中,水解TG的脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是影响TG代谢的决定因素。LPL是一种TG的限速性水解酶,可以通过激活血浆中LPL水解TG,减轻高甘油三酯血症。各组织中LPL的改变可影响血浆中TG水平,影响脂质在脂肪组织的积聚,以及脂质在肌肉组织的氧化利用。因此,LPL被认为是改善血脂TG水平,影响脂肪在体内积聚还是氧化的干预性靶点。　　 LPL通过水解血中的TG控制血脂正常代谢。肌肉组织通过LPL产生游离脂肪酸(free fatty acid,FFA),FFA氧化分解提供能量。增加骨骼肌中LPL活性,可以使骨骼肌中的β-脂肪酸氧化增强,从而加速清除体内循环的TG。脂肪组织的一个主要功能就是储存脂肪。降低脂肪组织中的LPL,可以减少脂肪组织利用LPL水解TG产生的FFA来合成脂肪,使FFA转移到其他具有高氧化分解作用的组织,如肌肉组织进行氧化分解。目前认为,高的脂肪/肌肉LPL(adipose/muscle LPL ratio)比,意味着使食物中摄入的脂肪更易积聚在脂肪组织；低的脂肪/肌肉LPL比,则意味着循环中的TG会更多的流向骨骼肌氧化利用,而不是流向脂肪组织积聚。这有利于抑制脂肪在脂肪组织中的储存,减轻体重。　　 众所周知,一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是细胞中能量控制的关键,被称为细胞的“能量控制阀”。AMPK可以阻断消耗能量的代谢,如TG的合成,反之,可以促进ATP产生的一系列代谢。细胞内AMP/ATP的改变可以调节AMPK的活性,是脂代谢的重要调控因素。在骨骼肌中,AMPK可以通过乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme Acarboxylase)促进FFA的氧化分解；在脂肪组织中,AMPK使脂肪细胞转化为脂质氧化型细胞,抑制脂肪形成。　　 目前研究表明,AMPK可以调节不同组织中LPL的表达和活性,是LPL的上游调节因子。磷酸化的AMPK可以降低脂肪细胞的LPL表达,增强肌肉细胞的LPL表达。因此,AMPK-LPL可能是抑制肥胖和调节TG代谢的重要信号通路。　　 动物和人群实验均显示,植物膳食有着抑制肥胖和脂代谢紊乱的显著作用。进一步实验表明,植物膳食中植物化学物是其作用的决定因素。花色苷是一种黄酮类(flavonoid)植物化学物,是一种自然存在的植物色素,具有一定的药理特性。花色苷(anthocyanin)有诸多疗效,如抗氧化,抗动脉粥样硬化,抗胰岛素抵抗,调节血脂等。目前,有报道证明紫玉米花色苷可以抑制小鼠肥胖,黑米花色苷可以改善动物血脂异常,但其有效成分和作用机理不清,推测是含量为7％的矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-β-glucoside,Cy-3-g)起了主要作用。　　 为了进一步明确Cy-3-g抑制肥胖和改善血脂的作用及其机制,本研究通过在KKAy小鼠膳食中添加Cy-3-g(1g/kg diet)干预12周,观察Cy-3-g对小鼠体重,血脂,内脏脂肪和皮下脂肪重量,脂肪组织的细胞体积,肝脏脂肪沉积的影响,以及对血浆,脂肪,肌肉等组织中LPL,pAMPK的影响,探讨Cy-3-g通过调节LPL活性对KKAy小鼠TG代谢的作用。本研究进一步通过骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞实验,探讨Cy-3-g是否通过AMPK—LPL信号通路产生作用。KKAy是一种转基因小鼠,可以在相对低的能量摄入条件下引起肥胖和高脂血症,是本实验的理想动物模型。　　 研究方法:　　 1.动物实验　　 (1)动物分组、膳食干预及处理　　 16只KKAy小鼠(雌性),6周龄,按体重随机分为2组进行试验(n=8),对照组(Control Group),Cy-3-g添加组(Cy-3-g Group)。对照组以AIN-93G为饲料,Cy-3-g添加组的饲料为对照组饲料基础上添加Cy-3-g1g/kg diet(纯度≥95％,Polyphenol AS,Sandnes,Norway)。二组实验小鼠按组分笼喂养,自由饮水摄食,动物房室内温度为23±3℃,照明时间为每天08:00—20:00。为防止饲料氧化,饲料存放于-20℃,按实际摄入量每2天添加一次饲料。每周一次称量二组小鼠体重,记录摄食量,共进行12周膳食干预。　　 (2)采血及脏器收集　　 12周后,小鼠以1.0％戊巴比妥钠麻醉,经眼眶一次采血,用于血脂分析；尾静脉注射肝素钠((100 IU/kg体重)10 min后,摘除眼球二次采血,用于LPL活性测定。新鲜血液离心分离血浆,4℃下1600g离心15 min,分装保存于-80℃待测。取小鼠内脏脂肪(可见的肠系膜脂肪,肾周,肝周,脾周脂肪组织)(Viscera adipose tissues,VAT),腹部皮下脂肪(subcutaneous adipose tissue,SAT),肌肉组织(后腿肌肉),肝脏；精确称重内脏脂肪,皮下脂肪；取部分内脏脂肪,皮下脂肪及肝脏于10％福尔马林保存,其余置于-80℃保存。　　 (3)血脂及肝脏TG检测分析　　 试剂盒(中北生物,北京,中国)测定血浆总胆固醇(TL),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白(HDL),低密度脂蛋白(LDL)。取肝组织100 mg,按1:9重量体积比加入冷PBS,匀浆后,于2500 rpm,10 min,取上清液即10％匀浆液,检测肝脏TG水平。　　 (4)内脏脂肪,皮下脂肪及肝脏组织切片　　 保存于10％福尔马林液中的内脏脂肪,皮下脂肪及肝脏组织,冷冻切片,通过苏木素-伊红染色(haematoxylin and eosin,HE)。测定脂肪细胞直径,一张切片随机取3个视野,每个视野中随机取100个细胞,计算脂肪细胞的细胞直径(μm)。测定肝脏脂肪肝病变程度,一张切片随机取3个视野,计算脂肪肝病变程度,脂肪肝病变程度按肝细胞中出现空泡程度打分,分0-4,0(<5％),1(5—20％),2(20％-30％),3(30—60％),4(≥60％)。　　 (5)血浆及各组织中LPL活性测定　　 取血浆样本直接进行检测。称取组织的重量,按1:4的重量体积比加入生理盐水,匀浆后,于2500 g,离心10 min,取上清液进行测定。上清液中LPL水解甘油三油酸酯产生FFA,计算LPL活性。每小时(hr)在反应系统所产生的1微摩尔(μmol)的游离脂肪酸FFA为一个酶活性单位(U)。表示为:U/毫升(ml)或毫克蛋白(mg)。　　 (6)组织中(内脏脂肪,皮下脂肪,肌肉)LPL及pAMPK(Thr172)蛋白表达Western Blot法检测LPL,pAMPK(Thr172)蛋白表达。LPL抗体(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruze,CA),pAMPK(Thr172)抗体(Cell SignalingTechnology,Danvers,MA),AMPK抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,MA),β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruze,CA)用于测定。　　 2.细胞实验　　 (1)原代骨骼肌细胞分离及培养　　 取30g左右KKAy雌性小鼠,无菌条件F取后腿骨骼肌剪碎,37℃下用1μg/ml胰酶的DMEM消化,4℃下2000 rpm离心5 min,沉淀物用含10％的胎牛血清DMEM重悬,80μm尼龙滤网过滤,细胞2×106接种于35 mm的培养皿中,每日更换培养基。　　 (2)原代成熟脂肪细胞分离及培养　　 取30g左右KKAy雌性小鼠,自由饮水摄食(AIN-93G),动物房室内温度为23±3℃,照明时间为每天08:00-20:00,喂养3天,断颈法处死。无菌条件下取肠系膜脂肪组织,放入含0.5％牛血清白蛋白以及76.6 U/ml胶原酶的HEPES-KRBH缓冲液(30 mmol/L)剪碎,37℃消化90 min,250μm尼龙滤网过滤,重复离心重悬,用含0.5％牛血清白蛋白的HEPES-KRBH缓冲液(30mmol/L)洗涤4次,用含0.5％牛血清白蛋白的DMEM培养。　　 (3)Cy-3-g干预细胞　　 上述方法培养的骨骼肌细胞,成熟脂肪细胞,分别用0,1,10,20,50,100μmol/L Cy-3-g干预3 hr,100μmol/L Cy-3-g干预0,1,2,3,4,5 hr。0μmol/L为0.1％的二甲基亚砜(Cy.3-g溶剂)。(4)Cy-3-g干预后细胞LPL活性测定　　 细胞加入0.1 mol/LTris(pH7.4),冰上超声破碎30 sec,2000 g离心10 min,上清液用于测定LPL活性。细胞提取上清液中LPL水解甘油三油酸酯产生FFA,计算LPL活性。LPL活性定义为每小时(hr)在反应系统所产生的1微摩尔(μmol)的游离脂肪酸FFA。　　 (5)Cy-3-g对骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞LPL mRNA的调控　　 通过检测骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞中LPL mRNA表达来验证Cy-3-g对LPL的调节。荧光定量RT-PCR法测定LPL mRNA水平。　　 LPL:(F):5-ACTCGCTCTCAGATGCCCTA-3(R):5-TTGTGTTGCTTGCCATTCTC-3.β-actin:(F):5-AGTGTGACGTTGACATCCGTA-3,(R):5-GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT-3　　 (6)Compound C抑制细胞pAMPK　　 骨骼肌细胞,成熟脂肪细胞,加入AMPK抑制剂Compound C(Calbiochem,Merck KGaA,Darmstadt,Germany)40μmol/L预处理1 hr后,100μmol/LCy-3-g干预3 hr。　　 (7)细胞瞬时质粒转染　　 骨骼肌细胞,成熟脂肪细胞,分别用DN-AMPK cDNA质粒,pcDNA3.0质粒(平行对照组)转染预处理24 hr后,100μmol/L Cy-3-g干预3 hr。　　 (8)细胞中LPL及pAMPK(Thr172)蛋白表达　　 Western Blot法检测LPL,pAMPK(Thr172)蛋白表达,同方法1,项(6)。　　 研究结果:　　 1.动物实验　　 (1)小鼠体重,摄食量以及脏器重量　　 二组小鼠在实验期间体重均有增长趋势,平均摄食量未出现显著性差异(p>0.05)。干预第11、12周,Cy-3-g组小鼠体重与对照组比有显著性降低。干预第12周,Cy-3-g组小鼠体重较对照组低3.1±1.8 g(p<0.05)(43.2±1.7,40.1±1.8g,对照组vs Cy-3-g组)；内脏脂肪重量较对照组低3.5±1.7 g(p<0.05)(16.0±1.7,12.5±1.5 g,对照组vs Cy-3-g组)。皮下脂肪重量二组无显著性差异(p>0.05)。　　 (2)Cy-3-g膳食干预对小鼠血脂的影响　　 Cy-3-g组小鼠血浆中TG含量与对照组比下降47％(3.67±0.06,2.14±0.04mmol/L,对照组vs Cy-3-g组)(p<0.05)。血浆中的总胆固醇TC,高密度脂蛋白HDL-C,低密度脂蛋白LDL—C均无显著性差异(p>0.05)。　　 (3)Cy-3-g膳食干预对小鼠内脏脂肪和皮下脂肪细胞大小的影响　　 用HE染色,测定脂肪细胞的直径。Cy-3-g组小鼠内脏脂肪和皮下脂肪细胞直径大小较对照组比,分别下降37.3％,9.55％(p<0.001,p<0.01)。　　 (4)Cy-3-g膳食干预对小鼠脂肪肝的影响　　 KKAy小鼠经12周喂养,肝脏会积聚较多脂肪,Cy-3-g组小鼠肝脏显示出较轻的脂肪积聚(P<0.001),其TG含量也显著减少(p<0.001)。　　 (5)Cy-3-g膳食干预对小鼠LPL和pAMPK的影响　　 Cy-3-g组小鼠LPL活性与对照组相比,血浆中升高35.3％(p<0.05),内脏脂肪中降低37.9％(p<0.05),肌肉中升高26.0％(p<0.05),而皮下脂肪无显著性变化(p>0.05)。Cy-3-g组内脏脂肪与肌肉LPL活性比值较对照组降低50.3％(p<0.05)。　　 Western Blot法测定内脏脂肪,皮下脂肪,肌肉中LPL与pAMPK(Thr172)的蛋白表达。Cy-3-g组中小鼠内脏脂肪和肌肉组织pAMPK蛋白表达水平分别较对照组升高2.2倍和2.0倍(p<0.001),但皮下脂肪pAMPK蛋白表达无差异(p>0.05)。与对照组相比,Cy-3-g组中小鼠内脏脂肪LPL蛋白表达水平明显降低,为对照组的小鼠0.33倍(p<0.001)；但肌肉组织LPL蛋白表达水平显著升高,为对照组的2.5倍(p<0.001)。皮下脂肪LPL蛋白表达无差异(p>0.05)。　　 2.细胞实验　　 (1)Cy-3-g增加骨骼肌细胞LPL活性和表达,而减少成熟脂肪细胞LPL活性和表达　　 Cy-3-g增加骨骼肌细胞LPL活性,减少成熟脂肪细胞LPL活性,均有时间和剂量效应。同样的,Cy-3-g增加骨骼肌细胞LPL mRNA和蛋白表达,减少成熟脂肪细胞LPL mRNA和蛋白表达,均有时间和剂量效应。　　 (2)Cy-3-g通过激活AMPK调节骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞LPL　　 骨骼肌细胞用100μmol/L Cy-3-g干预3 hr,激活AMPK(p<0.001),同时增加LPL蛋白表达(p<0.001)。用AMPK抑制剂Compond C可以阻断Cy-3-g对骨骼肌细胞AMPK的激活(p<0.001),同时LPL蛋白表达不增加(p>0.05)。成熟脂肪细胞同样用Cy-3-g100μmol/L干预3 hr,激活AMPK(p<0.001),同时减少LPL蛋白表达(p<0.001)。用AMPK抑制剂Compond C可以阻断Cy-3-g对成熟脂肪细胞AMPK的激活(p<0.001),同时LPL蛋白表达不减少(p>0.05)。　　 骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞经pcDNA3.0质粒瞬时转染24 hr作为平行对照组,用100μmol/L Cy-3-g干预3 hr,均可以激活AMPK(p<0.001),增加骨骼肌细胞LPL蛋白表达(p<0.001),降低脂肪细胞LPL蛋白表达(p<0.001)。利用DN-AMPK质粒转染骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞,抑制了它们AMPK活性(p<0.001),阻断了由Cy-3-g激活AMPK诱导的LPL调节(p<0.001)。综上所述,pAMPK是Cy-3-g调节骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞LPL的上游调节因子。　　 结论:　　 KKAy小鼠经Cy-3-g膳食干预12周,体重和内脏脂肪重量减轻,血脂TG水平下降,脂肪组织细胞体积减小,肝脏脂肪沉积减轻,肌肉组织和内脏脂肪pAMPK升高,血浆LPL活性升高,LPL活性和表达在骨骼肌升高而在内脏脂肪下降。其作用机制可能为Cy-3-g通过激活AMPK调节LPL途径,改善了KKAy小鼠TG代谢。