研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC,以下简称肝癌),是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。其发病率在世界范围内呈上升趋势,且具很高复发率和死亡率。由于其侵袭性强和发展迅速,大多数肝癌患者在确诊时已近晚期,失去了手术根治机会。因此,超过70%的肝癌需要接受非根治性的治疗方法,如肝动脉栓塞化疗、索拉非尼治疗或系统性化疗,但收效甚微。尤为甚者,在我国肝癌多合并肝纤维化、肝硬化背景。研究发现,肝纤维化、肝硬化、肝癌都是肝实质细胞与肝间质细胞相互作用的结果,这其中星状细胞(hepatic stellate cell, HSC),作为肝间质细胞的主要组成,与炎症关系密切,受多种因素刺激,增殖活化,表达α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)并大量合成细胞外基质(extracellular matrix, ECM),成为肝纤维化等慢性肝病细胞外基质和胶原产生的主要细胞来源,被认为是肝纤维化的中心环节。而伴随着HSC的激活、增殖,肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)的形成,以及与ECM共同构成的组织微环境可能促成了肝干细胞或肝细胞向肝癌细胞的转化,并在肝癌的进一步增殖、侵袭、转移过程中发挥作用。如此,肝癌细胞和星状细胞间一定存在着密切的联系,而这种联系也许可成为肝癌治疗的又一靶点,即通过调节肝癌微环境中的星状细胞进而抑制肝癌。中医药抗纤维化和肿瘤治疗历史悠久,为我们发展有中国特色的抗肝癌研究提供了一条可探索之路。依托前人的经验和前期的研究基础,我们应用本所研制的含黄芪、丹参、山楂、鳖甲、枸杞五味成份的中药小复方“松友饮”,对有肝纤维化背景的裸鼠原位移植瘤施以干预,并重点通过研究其对于肝癌纤维化微环境中的星状细胞的作用,最终找到“松友饮”抑制有肝纤维化背景肝癌恶性潜能的可能机制。目的：应用中药小复方“松友饮”(SYY)对有肝纤维化背景荷人肝癌裸鼠进行干预,试图证明“松友饮”通过对肝纤维化微环境中的肝星状细胞(HSC)发挥影响而抑制肝癌的恶性潜能,并进一步探索其可能的作用机制。方法：1、5-6周龄裸鼠30只,皮下注射四氯化碳(四氯化碳/橄榄油：50：50),每周一次,每只裸鼠5 ul/g,自注射第四周末开始,每隔两周颈椎脱臼法处死6只裸鼠,共计10周,动态观察肝脏大体标本变化,利用组织病理切片和免疫组化技术,对裸鼠纤维化程度进行鉴定。2、20只裸鼠随机平均分为4组,原位接种高转移人肝癌细胞HCCLM3皮下瘤组织块,原位种瘤后3天,其中两组开始予以四氯化碳皮下注射(5 ul/g/只/周),另外两组予以同等剂量的生理盐水处理,同时,在上述两种处理方法下各有一组开始自由饮用SYY (2g/Kg/日),6周后全部裸鼠脱颈处死,观察肝脏变化及成瘤情况,提取肝组织作病理检查；5-6周龄裸鼠45只,随机均分为9组,4组作为实验组,4组作为对照组,1组作为观察组,实验组每组裸鼠皮下分别注射不同数量级的高转移人肝癌细胞HCCLM3(0.1ml)和人肝星状细胞LX2 (0.1ml,1×105)的混合细胞共计0.2ml,对照组每组皮下注射相应数量级的HCCLM3细胞(0.2ml)而不混合LX2,最后1组在皮下单独注射LX2细胞2×105(0.2ml),12周后全部裸鼠脱颈处死,观察皮下成瘤情况；5-6周龄裸鼠15只,随机平均分成3组,取两组,每只裸鼠皮下注射1×106LX2 (0.1ml)和1×105HCCLM3 (0.1ml)的混合细胞,其中一组作为实验组开始自由饮用SYY (2g/Kg/日),另一组作为对照组正常饮食,第三组裸鼠皮下注射1×106 (0.2ml) LX2细胞,正常饮食,6周后所有裸鼠脱颈处死,观察皮下成瘤、肺转移,提取肝、肺组织作病理检查。3、利用CCK8实验和乳酸脱氢酶释放实验(LDH)检测“松友饮”对LX2的增殖抑制和毒性作用；取浓度(8mg/ml)SYY加入正常培养基培养LX2细胞48h,取其上清作为条件培养基再分别培养HCCLM3、Hep3B细胞,并以此作为实验组,两组细胞的对照组则采用正常培养LX2培养基上清作为条件培养基进行培养,同时,再取加入了同样浓度的SYY的正常培养基培养上述两种细胞,同样设立正常培养基作为对照组,以上各组细胞再分别进行克隆形成实验、CCK8实验和transwell侵袭实验；抽提经SYY处理过48h的LX2细胞的总RNA作为实验组,对照组为正常培养状态下的LX2细胞的总RNA,进行全基因组表达谱芯片分析,得到差异基因中的核心调控基因及与之相关的信号通路；利用蛋白免疫印迹(Western-blot)对核心基因编码的蛋白及调控该信号通路的关键蛋白进行验证；利用酶联免疫吸附实验(Elisa)对两组细胞分泌上清中的相关蛋白进行验证。4、应用SPSS13.0软件进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、应用四氯化碳皮下间断注射法成功建立裸鼠肝纤维化模型；免疫组化显示作为肝纤维化过程中心环节的星状细胞,其活化阶段的标志性蛋白“α-SMA"的表达强度与肝纤维化进展正相关。2、四氯化碳诱导肝纤维背景下的肝癌瘤重大于正常肝脏背景下的原位移植瘤,每日自由饮用2g/Kg剂量的SYY对于肝纤维化背景下裸鼠的肝癌生长有明显抑制作用,同样剂量的SYY对于正常肝脏背景下的肝癌生长无明显抑制作用,免疫组化(α-SMA染色)提示：肝纤维化背景下的裸鼠肝癌及癌周存在大量活化的星状细胞；细胞数量小于1×105的HCCLM3肿瘤细胞不能单独皮下成瘤,细胞数量小于1×105的HCCLM3肿瘤细胞在混合了同样数量的LX2细胞后,可以皮下成瘤,而相同数量的LX2细胞不能单独成瘤；自由饮用SYY对于接种了HCCLM3和LX2混合细胞的裸鼠皮下瘤的生长有明显抑制作用,单独接种同样数量HCCLM3肿瘤细胞的裸鼠不能皮下成瘤,裸鼠混合皮下瘤组织切片HE和Sirius染色提示：两组皮下瘤内均存在大量的纤维细胞和胶原纤维组织,自由饮用SYY的裸鼠混合瘤组织内细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和α-SMA阳性染色累积光密度值均明显小于对照组,两组皮下瘤组织内PCNA和a-SMA免疫荧光双染也呈现同样的结果,SYY对于裸鼠混合皮下瘤的肺转移也有明显抑制作用。3、CCK8实验和乳酸脱氢酶释放实验显示“松友饮”(8mg/ml)对于人肝星状细胞LX2没有增殖抑制和急性毒性作用；经SYY处理过LX2的条件培养基培养HCCLM3和Hep3B两种肿瘤细胞均提示能够减弱其克隆形成能力,并明显弱化了两种细胞的增殖能力和侵袭能力,而经SYY直接处理的两种肿瘤细胞在上述三个实验中与对照组相比较没有明显差异；全基因组芯片显示,与对照组相比较,经SYY处理过的LX2细胞中：上调的基因有1205个,下调的基因有1323个,这其中与细胞增殖、凋亡、生长、分化相关的一些基因表达明显下调(如：PIK3CD,AKT,IGF1R，TGF-β),并由此筛选出发挥关键作用的信号通路PI3K/AKT;Western-blot结果证实：经SYY处理后的HSC,其细胞内调节PI3K/AKT信号通路的一些关键蛋白的表达明显下调：Elisa结果显示：经SYY处理后HSC所分泌的上清中,影响肝癌增殖,分化,侵袭的一些主要蛋白的表达受PI3K/AKT信号通路的下调明显降低。结论：1、应用四氯化碳皮下间断注射法,可以成功建立实验性裸鼠肝纤维化动物模型；2、肝纤维化过程中星状细胞的活化程度与纤维化的进展正相关；3、“松友饮”(SYY)对于肝纤维化背景下肝癌的生长有明显抑制作用；4、活化的星状细胞(activated hepatic stellate cell, aHSC)与肝癌细胞混合接种对肝癌细胞的成瘤有明显促进作用；5、SYY对于aHSC和肝癌细胞混合皮下瘤的生长有抑制作用；6、SYY对aHSC和肝癌细胞混合皮下瘤肺转移有抑制作用；7、SYY对于aHSC和肝癌细胞混合皮下瘤生长的抑制作用与aHSC密切相关；8、SYY通过影响aHSC的旁分泌抑制肝癌细胞的恶性潜能；9、PI3K/AKT信号通路的下调是SYY通过影响aHSC抑制有肝纤维化背景肝癌恶性潜能的主要作用机制之一。