论文部分内容阅读
目的针对阿德福韦酯存在剂量依赖性肾毒性、生物利用度低等缺点,依据前药设计理念,结合肠肝循环特性,采用生物电子等排、结构骈合原理,以阿德福韦为先导化合物,设计合成阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物,拟提高药物在肝细胞中的富集浓度和生物利用度。方法（1）目标化合物的合成:将带有N-Boc-保护的L-氨基酸于-25℃在N-甲基吗啉（NMM）和氯甲酸异丁酯（IBCF）存在条件下通入硫化氢气体,制备N-Boc-L-硫代氨基酸,再将其与1,2-二溴乙烷或1,3-二溴丙烷反应得到N-Boc-L-硫代氨基酸-2-溴乙酯或N-Boc-L-硫代氨基酸-3-溴-1-丙酯。以熊去氧胆酸/去氧胆酸为反应底物,通过与3-溴-1-丙醇在DCC/DMAP存在条件下发生缩合反应,制备熊去氧胆酸-3-溴-1-丙基酯/去氧胆酸-3-溴-1-丙基酯。将上述制备的产物,在N,N’-二环己基-4-吗啉基脒（DCMC）条件下,与阿德福韦通过“一锅合成法”缩合,产物经柱色谱分离纯化得阿德福韦N-Boc-单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物,经85%磷酸/氯仿体系进行脱Boc处理,得最终化合物阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物;（2）利用UPLC-MS/MS方法考察了目标化合物在人工胃液、人工肠液、大鼠空白血浆、肝微粒体中的稳定性及代谢规律;（3）采用稳定表达HBV-DNA的HepG 2.2.15细胞系,评价合成的目标化合物体外对HBV-DNA的抑制作用;（4）采用钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP）转染Hek 293细胞考察抗病毒活性较好的化合物在转染细胞中的摄取机制;结果（1）合成阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物共计16个,总产率为12.6-25.2%,所得目标化合物结构经1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS和ESI-HRMS鉴定确证;（2）对受试化合物进行体外稳定性及代谢规律研究,结果显示,受试化合物在人工胃液中稳定性良好,在大鼠空白血浆、大鼠肝微粒体中的稳定性较阿德福韦酯好,半衰期长于阿德福韦酯,在人工肠液中稳定性较阿德福韦酯差,半衰期短于阿德福韦酯,其中化合物6d在肝微粒体中的裂解规律经初步分析,首先经过肝微粒体水解生成阿德福韦单去氧胆酸丙酯衍生物,再进一步水解成为原药阿德福韦;（3）体外抗HBV活性实验结果显示,8个受试化合物（6d,6e,6f,6g,6i,6l,6m,6n）均具有抗HBV活性,其中化合物6d,6i,6l,6m,6n的抗病毒活性及作用选择性指数(EC50 3.9529.41μmol·L-1,SI 89.50454.07)与阳性对照阿德福韦酯(EC50 3.09μmol·L-1,SI 142.04)相当,化合物6l的抗病毒活性最强、作用选择性指数最高(EC50 3.95μmol·L-1,SI 454.07)。（4）通过NTCP转染Hek-293细胞考察了其摄取机制,结果表明所有受试化合物（ADV,6d,6l,6m,6n）在稳定转染HEK 293细胞与未稳定转染HEK 293细胞中的摄取量均随着浓度的增加而增加,在同一浓度下受试化合物（6d,6l,6m,6n）在稳定转染NTCP的HEK293细胞中的摄取量显著高于未转染的HEK 293细胞（P<0.05）;且摄取率为6l>6m>6n>6d;而阳性对照阿德福韦酯在稳定转染HEK 293细胞与未稳定转染HEK 293细胞其摄取率随着浓度的增加未见明显正相线性关系增加;在稳定转染HEK 293细胞与未稳定转染HEK 293细胞中摄取率在统计学上未见明显差异（P≥0.05）;结论首次合成16个未见文献报道的目标化合物,稳定性与代谢机制研究发现目标化合物在酸性条件下稳定性较好,在富含酶的中性、碱性等环境中稳定性较差,其在在肝微粒体酶的作用下先后断裂得阿德福韦,进而发挥抗病毒活性;抗病毒活性测试显示部分化合物具有较高抗HBV活性,其中化合物6l活性最好;摄取机制研究表明目标化合物能够借助于肝细胞膜特异性表达的NTCP实现其肝靶向性富集的特性。