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支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是存在于猪呼吸道中一种重要的革兰氏阴性病原菌,可引起猪肺炎和猪萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis,AR)。该菌是猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)的重要致病因子之一,且易与其它多种病原微生物发生混合感染,增加猪群呼吸道疾病的发病率和复杂程度,从而给养猪业带来经济损失。Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion system,T6SS)是存在于大多数动物革兰氏阴性细菌中的一种蛋白分泌系统,是一个固定于胞质中且跨越内膜、周质、外膜的管状结构复合体,结构上类似于可收缩的噬菌体尾部。T6SS激活后可转运相关的效应因子到靶细胞内,与许多致病菌中与致病性相关。溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein,Hcp)是T6SS复合体中重要的管道结构蛋白,也可作为效应蛋白发挥一定的生物学效应,是功能性T6SS的标识。以实验室分离的支气管败血波氏杆菌QH0814菌株作为亲本株,使用自杀性质粒介导的两步单交换同源重组的方法,构建hcp基因缺失株QH0814Δhcp,对其基本的生物学特性进行研究。主要研究内容如下:1.支气管败血波氏杆菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp的构建以QH0814为模板扩增hcp基因上下游同源臂,串联构建重组自杀性质粒p RE-Δhcp,通过接合转移将重组自杀性质粒导入亲本菌中,利用氯霉素(Cm)抗性基因进行筛选获得单交换接合子,随后继续在无抗性的TSB培养基中传代培养,促进无抗性同源重组的发生,使用引物进行PCR检测,缺失株只能扩增到500bp片段,并对此片段进行测序验证正确,即获到hcp基因缺失株QH0814Δhcp。2.支气管败血波氏杆菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp生长特性对缺失株连续培养50代,使用PCR鉴定缺失片段处未发生回复突变,说明该基因缺失后具有一定的遗传稳定性。挑取缺失株和亲本株的单菌落,分别接种于TSB培养基中培养,再以1:1000的比例转接于新鲜培养基中,培养过程中每2h取样检测菌液OD600值绘制生长曲线,发现亲本株与缺失株的生长无显著差异,表明在体外培养条件下,hcp基因的缺失对菌体体外生长无明显影响。3.Hcp多克隆抗体的制备及鉴定以QH0814为模板扩增hcp基因全长,构建原核表达质粒pET30a-hcp,转化于BL21进行诱导表达并使用SDS-PAGE检测,表达蛋白以包涵体的形式存在,溶解包涵体并进行纯化,获得目的蛋白。将所得的蛋白作为免疫蛋白,免疫5周龄的小鼠,免疫完成后采血清进行Western Blot检测,确定所制备的血清具有反应性和特异性。4.支气管败血波氏杆菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp致病性的研究将亲本株与缺失株分别以10~5、10~6、10~7、10~8的剂量腹腔接种于对5周龄的昆明鼠,记录死亡情况并计算LD50的值。结果显示,与亲本株QH0814比较,缺失株QH0814Δhcp的毒力降低了约2倍。以106 CFU的剂量腹腔接种5周龄的昆明鼠对血液中的菌量及肺脏和肝脏载菌量进行计算比较。结果显示,与亲本株相比,QH0814Δhcp在血液中菌量降低了5倍,肺脏的载菌量降低了7倍,肝脏的载菌量降低了4倍。hcp基因缺失后,血液中的菌量和组织中的载菌量均显著下降,且肺脏下降幅度最大,推测hcp基因与菌体在机体内定植有一定的关系。使用小鼠巨噬细胞(RAW264.7)以100:1进行吞噬实验。结果表明,随着作用时间的推移,细菌不断被细胞吞入。RAW264.7细胞对亲本株的吞噬率基本较为稳定,而对缺失株的吞噬率逐渐增加,说明hcp基因缺失之后,细菌更容易被吞噬细胞吞噬,即更容易被机体清除。使用猪肾上皮细胞PK-15进行粘附入侵试验。结果表明,与亲本株相比,QH0814Δhcp的粘附能力差异不显著,而入侵能力显著降低,大约降低3倍。推测hcp基因与菌体的侵袭性有一定的关联。