丁酸是一种市场容量巨大的基础化学品和精细化工品,广泛应用于食品、化学和医药领域。NADH作为酪丁酸梭菌(Clostrdium tyrobutyricum ATCC 25755)代谢网络中的一种关键辅因子,对其形式与浓度的调节可以实现代谢流最大化、快速化地流向目标代谢产物丁酸。本论文通过基因工程手段调节酪丁酸梭菌胞内NADH与NAD~+的比率,从而提高发酵产物中丁酸的浓度和选择性,降低生物丁酸的生产成本。在C.tyrobutyricum ATCC 25755野生菌中,我们通过以下代谢工程策略:1)过表达丁酸合成途径中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPA),提高胞内还原当量NADH的供给;2)过表达NADH依赖的丁酰辅酶A脱氢酶(BCD1)来加快丁酸合成支路上还原力NADH的消耗;3)共表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPA)与酰辅酶A脱氢酶(BCD1),成功获得了C.tyrobutyricum ATCC 25755/gap A、25755/bcd1和25755/gap A+bcd1三株工程菌,并且通过RT-PCR以及SDS-PAGE实验证实了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gap A)和丁酰辅酶A脱氢酶基因(bcd1)在酪丁酸梭菌中的成功表达,并且表达量相比于对照组明显提高。通过摇瓶与批次发酵结果以及胞内NADH/NAD~+比率的测定表明,单独过表达或共表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gap A)或(和)丁酰辅酶A脱氢酶基因(bcd1)可以强化胞内的NADH和NAD~+的消耗和再生,实现胞内NADH/NAD~+的调控,全面提高丁酸的终浓度、得率和选择性。与高浓度葡萄糖批次丁酸发酵相比,分批补料发酵虽然导致丁酸的生产速率降低,但是可以有效延长发酵时间,使得重组菌株可以实现乙酸的重吸收和丁酸的积累。发酵结束时,三株工程菌副产物乙酸的含量均有大幅度的降低,其中ATCC 25755/gap A+bcd1表现最为优异,与对照相比,乙酸含量降低56.28%,导致丁酸/乙酸的比率提高154.09%,此外,丁酸的产量也得到提高,丁酸终浓度达到了59.53 g/L,相比于出发菌株提高了11.16%。采用纤维床固定化补料发酵模式可以进一步提高酪丁酸梭菌的丁酸产量、生产速率和得率。其中,工程菌25755/gap A+bcd1的发酵性能提升最为显著,丁酸的产量、生产速率和得率分别达到了63.75 g/L、0.85 g/L·h和0.36 g/g,相比于游离细胞分批补料发酵提高了7.1%、34.9%和12.5%。此外,与对照相比,副产物乙酸的含量由9.14 g/L降至5.25 g/L,丁酸/乙酸的比率提高97.88%。在C.tyrobutyricum ATCC 25755中,通过过表达与辅因子NADH合成和代谢相关酶,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPA)和丁酰辅酶A脱氢酶(BCD1),实现了胞内NADH与NAD~+比率的调控和丁酸合成的强化;通过对发酵模式的选择,实现了乙酸的重吸收和丁酸的高效合成,全面提升了丁酸的发酵水平,提高了生物丁酸的经济性。综上所述,酪丁酸梭菌丁酸的代谢网络与辅因子调控网络之间存在着密切的联系,因此利用辅因子工程控制其代谢流流向和通量分配是一种有效的代谢工程手段。