第一部分 TBI后皮质损伤区BLBP表达变化及其对星形胶质细胞增殖的影响　　目的：　　探讨成年大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）后大脑皮质损伤区域脑脂结合蛋白（brain lipid binding protein，BLBP）的表达变化及其对体外培养大鼠胶质瘤细胞C6增殖、迁移能力及侵袭性的影响。　　方法：　　1．SD大鼠随机分为对照（Control）组和TBI组；　　2．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d应用免疫荧光法检测大鼠损伤区皮质BLBP、GFAP表达情况并计数BLBP+/GFAP+细胞；　　3．提取TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠损伤区周围脑皮质总蛋白，Western blot检测BLBP蛋白表达；　　4．体外培养C6细胞，分为LV-BLBP和LV-NC两组，取最佳MOI时C6细胞总蛋白和总RNA，Western blot和real-time PCR检测C6细胞病毒感染后BLBP蛋白和mRNA表达；　　5．EdU标记S期C6细胞，免疫荧光技术和流式细胞术检测C6细胞增殖水平；　　6．CCK-8检测培养0h、24h、48h、72h、96h和120h C6细胞活力；　　7．两组细胞在10％FBS培养条件和1%FB的培养条件培养3d，提取总蛋白Western blot检测细胞周期相关蛋白p16、p21、p27的表达；　　8．划痕实验和Transwell实验检测C6细胞迁移能力及侵袭性。　　结果：　　1．伤后1d、3d、7d、14d、21d和28d损伤区皮质均能观察到BLBP+/GFAP+的细胞，伤后7d细胞数量达到高峰而后逐渐下降，28 d时仅能在损伤区皮质边缘观察到少量BLBP+/GFAP+细胞。对照组大鼠皮质偶见阳性细胞。　　2．TBI后损伤脑区BLBP蛋白表达：TBI后损伤区周围皮质BLBP表达量明显上升，7d时达到高峰，随后缓慢下降，至28d依然高于正常组。　　3．Western blot结果显示感染BLBP过表达重组慢病毒后C6细胞显著表达BLBP蛋白，琼脂糖凝胶电泳检测可见感染BLBP之后C6细胞能够转录BLBP mRNA。　　4．免疫荧光和流式细胞术检测EdU标记增殖态C6细胞，结果显示10%FBS培养条件感染BLBP后细胞EdU阳性细胞更多，与空病毒组相比差异有统计学意义。改变培养条件至1%FBS培养基依然可见BLBP感染组EdU阳性细胞比例明显较空病毒组高。　　5．CCK-8检测C6细胞活力：10%FBS培养条件下与空病毒组比较BLBP感染后C6细胞在24h、48h、72h和96h细胞活力高于空病毒组。1%FBS培养条件BLBP感染组C6细胞在72h、96h和120h细胞活力高于空病毒组。　　6．Western blot检测细胞周期相关蛋白p16、p21、p27表达：蛋白条带显示在10%FBS培养条件下BLBP感染组和空病毒组p16无明显差异，而在1%FBS培养条件下BLBP感染组p16蛋白表达明显下降，与空病毒组比较差异有统计学意义；p21蛋白的表达结果显示不管在10%FBS培养条件还是在1%FBS培养条件下BLBP均能有效降低其表达，组间比较差异明显；p27蛋白检测结果显示在两种培养条件下BLBP的表达与否均未能明显影响其表达。　　7．划痕实验和Transwell实验检测C6细胞迁移情况未见BLBP过表达和空病毒感染组C6细胞迁移能力有明显差异。　　第二部分体外培养C6细胞过表达BLBP基因芯片检测与分析　　目的：　　为探讨C6细胞过表达BLBP对相关下游基因表达影响，并分析、筛选感兴趣的靶基因。　　方法：　　1．体外培养C6细胞，分为LV-BLBP和LV-NC两组；　　2．基因芯片检测、分析；　　3．提取培养C6细胞总蛋白，Western blot检测C6细胞病毒感染后TGF-β2蛋白表达。　　1．基因芯片检测结果：以差异表达基因探针信号差异筛选出的264基因探针进入分析，过表达BLBP后相对于空病毒感染C6细胞有284个基因上调和250个基因下调。与神经细胞有关的基因中转化生长因子（transforming growth factor2，TGF-β2）编码基因在BLBP过表达后明显上调。　　2．Western blot检测C6细胞TGF-β2蛋白表达：蛋白电泳结果显示过表达BLBP后C6细胞TGF-β2蛋白表达明显上调，与空病毒组细胞比较差异有统计学意义。　　第三部分 TGF-β2对星形胶质细胞生物学行为的影响　　目的：　　探讨成年大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）后大脑皮质损伤区域转化生长因子（transforming growth factor-β2，TGF-β2）的表达变化及其对体外培养星形胶质细胞株HA1800增殖和迁移能力的影响。　　方法：　　1．SD大鼠TBI模型制备，分为对照组和TBI组；　　2．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d应用免疫荧光法检测大鼠损伤区皮质TGF-β2、GFAP表达情况并计数；　　3．取TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠损伤区周围脑皮质，提取总蛋白Western blot检测TGF-β2蛋白表达；　　4．体外培养人星形胶质细胞株HA1800细胞，分别给予0ng/mL、2ng/mL和10ng/mL外源性TGF-β2因子。3d后EdU标记S期HA1800细胞，检测细胞增殖状态；　　5．培养基中添加TGF-β2终浓度为0ng/mL、2ng/mL和10ng/mL，流式细胞术检测HA1800细胞周期，计数各期细胞占总细胞百分比，了解细胞周期状态；　　6.划痕实验检测不同浓度外源性TGF-β2对HA1800细胞迁移能力的影响。　　结果：　　1．免疫荧光检测结果显示伤后1d、3d、7d、14d、21d和28d损伤区皮质均能观察到TGF-β2+/GFAP+的细胞。伤后7d达到高峰而后逐渐下降，28 d时依然能在损伤区皮质边缘观察到较多的TGF-β2+/GFAP+细胞。对照组大鼠皮质未见TGF-β2+阳性细胞。　　2．Western blot结果显示TBI后TGF-β2表达量明显上升，7d时达到高峰，随后缓慢下降，至28d表达依然高于正常组。　　3．随外源性TGF-β2浓度的增加EdU阳性标记的细胞数目明显增多。　　4．流式细胞术检测结果显示外源性TGF-β2进入培养基后，HA1800细胞周期发生明显变化。随着TGF-β2在培养基中终浓度的上升，处于G2/M期的HA1800细胞数量逐渐增加，变化趋势与S期细胞类似，10ng/mL组最多；反之G1期细胞数量则呈下降趋势。　　5．划痕实验结果显示，不同浓度外源性TGF-β2干预后细胞均能向中央空白处迁移，尤以3h和6h时明显，至20h时空白处两侧的细胞已完全迁移进入并相互接触，组间比较以10ng/mL组细胞迁移效果最佳。　　第四部分 TBI后皮质损伤区TGF-β1的表达及其对神经干细胞分化的作用　　目的：　　探讨成年大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）后大脑皮质损伤区域转化生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达变化及其对体外培养大鼠NSCs分化的影响。　　方法：　　1．制备SD大鼠TBI模型；　　2．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d应用免疫荧光法检测大鼠损伤区皮质TGF-β1、IBA-1、GFAP表达情况；　　3．Western blot和Elisa检测TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠损伤区周围脑皮质TGF-β1表达变化；　　4．培养SD大鼠来源NSCs，分NSCs组、TGF-β1组、NSCs+Smad2 RNAi组和TGF-β1+Smad2 RNAi组，免疫荧光染色检测NSCs分化为Map-2阳性和GFAP阳性细胞情况。　　结果：　　1．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d损伤区皮质均能观察到GFAP+/TGF-β1+和IBA1+/TGF-β1+的细胞。损伤区皮质GFAP+/TGF-β1+细胞数量逐渐上升，伤后7d达到高峰而后逐渐下降，28 d时仅能在损伤区皮质边缘观察到少量TGF-β1+/GFAP+细胞。IBA1+细胞在损伤后一天即有表达，随时间点的延长IBA1+/TGF-β1+双标阳性细胞数量快速上升，3d后上升速度放缓至14d达到高峰而后逐渐下降，28d时损伤区周围偶见IBA1+/TGF-β1+阳性细胞。　　2．Western blot和Elisa检测结果显示，TBI后TGF-β1表达量明显上升，3d时达到高峰，随后缓慢下降，14d后形成平台期。　　3．体外培养NSCs给予不同浓度外源性TGF-β1因子干预，结果显示不同时间点均能见到GFAP+细胞数量变化，3d时间点2ng/mL TGF-β1干预后NSCs分化为GFAP+细胞较0ng/mL组明显增多，随着TGF-β1浓度的提高GFAP+细胞数未见增多，反而有所减少，但与0ng/mL组比较差异依然明显。7d时间点GFAP+细胞表现的趋势与3d时间点类似。　　4．MAP-2、GFAP免疫荧光检测Smad2 RNAi后NSCs分化情况：培养14d结果显示加入2ng/mL的TGF-β1后MAP2阳性细胞分化比例较正常NSCs分化比例下降明显。TGF-β1+Smad2 RNAi组MAP-2阳性细胞的比例较TGF-β1组有所增加，但未能达到正常培养组或NSCs+Smad2 RNAi组水平。　　结论：　　1．大鼠TBI后，损伤区皮质BLBP、TGF-β1/2表达上调，并能与GFAP共标；　　2．过表达BLBP能够通过下调细胞周期抑制蛋白p21、p16的方式来重置细胞周期并促进C6细胞增殖，但对C6细胞的迁移能力和侵袭性无影响；　　3．C6细胞过表达BLBP后能够上调TGF-β2的表达水平；　　4．TGF-β2表达上调能够促进HA1800细胞的增殖及迁移能力；　　5．外源性TGF-β1可能促进NSCs更多地向星形胶质细胞方向分化。