色盐杆菌ST307产PHB条件优化及其功能基因研究

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聚-β-羟丁酸(PHB)是生物质降解塑料PHA家族中最常见的一种,也是研究最为广泛、最为深入的一类材料。PHB以HB的单体形式构成的α-螺旋二级结构形成,结晶时高度立体专一,结晶度较大,大约为55%~80%。提纯成型的PHB的分子结构和物理性质如熔点、结晶度、抗张强度等类似于聚丙烯,在自然条件下能够被环境中存在的众多微生物彻底降解为CO2和H2O,具有良好的生物降解性,有助于缓解“白色污染”的问题,是一类环境友好型塑料。PHB具有良好的生物相容性且人体对其无强烈的免疫反应,经常被用作外科手术缝合线、牙齿补填材料、心脏支架、肘钉等固定材料,也可以作为血管、骨板的外科手术替代品,此外PHB材料具有电压性,也可以做成工业电压制品。色盐杆菌ST307属于中度嗜盐菌的一种,因其耐盐性相对高,在利用该菌进行工业生产时可从灭菌角度入手减少成本。实验室对其研究相对较多,目前已对其基因全序列进行测序,对其胆碱脱氢酶基因和甜菜碱合成酶基因进行了克隆分析。实验通过苏丹黑染色、紫外全波长鉴定色盐杆菌ST307可以产生并积累PHB,波长235 nm检测得到未经优化ST307的PHB产值为1.48 g/L,PHB占菌体干重的29.48%。通过6个单因素实验:盐浓度、碳源种类、氮源种类、碳氮比、碳氮源浓度以及培养时间,确定了色盐杆菌ST307产培养基的最佳培养基方案,每100 mL的PHB培养基含蔗糖5.25 g、胰蛋白胨1.5 g、七水合硫酸镁0.03 g、氯化钙0.01 g、磷酸二氢钾0.003g、三水合磷酸氢二钾0.01 g、磷酸二氢钠0.004 g、三氯化铁0.002 g、氯化钠6 g。CCD响应曲面实验设置四个因素:温度、转速、pH、装液量。每个因素设置3个水平,其中温度水平为:27、31和35℃;转速水平为:120、160和200 r/min;p H值水平为:6.0、7.0和8.0;装液量水平为:40、80和120 mL。最终得到最佳优化方案:使用量程为250ml的三角瓶发酵培养时当温度为20.09℃、摇床转速为200 r/min、p H为6.0、装液量为40.02 mL时,PHB产物的OD235可以达到1.59,PHB产量为6.78 g/L,这与第二章色盐杆菌ST307未经优化的PHB产值1.48 g/L相比提高了4.59倍。在测序得到的色盐杆菌ST307全基因序列找出ST307产PHB的功能基因phbA(ST307GL000184)、phb B(ST307GL000185)和phbC(ST307GL000186),基因反义链序列及蛋白质序列见附图1-3。色盐杆菌ST307的三个PHB功能基因位置相连,初步推断也位于同一操作子上,研究对这三个基因编码蛋白的跨膜区、二级结构、结构域进行预测,为后续研究其编码蛋白结构打下理论基础。
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