【摘 要】
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目的:使用高通量测序技术检测小鼠脑出血后mRNAs和miRNAs的表达,用生物信息学技术分析筛选出差异表达的mRNA-Egr2及其具有潜在相互作用的mi R-200a-3p。建立脑出血的在体和离体模型,观察mi R-200a-3p和Egr2的表达水平,并进一步探讨mi R-200a-3p通过Egr2对脑出血后血肿周围组织继发性炎性损伤的生物学调控作用,探索脑出血治疗的潜在靶点。方法:1.筛选目的m
【基金项目】
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国家自然科学基金（81660211）； 贵州省科技计划项目（黔科合基础[2020]1Y318）； 《lncRNA91H/CCL21介导神经细胞-小胶质细胞间相互作用在脑出血后炎性损伤的机制研究》,国家自然科学基金（项目批准号:81960230）；
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目的:使用高通量测序技术检测小鼠脑出血后mRNAs和miRNAs的表达,用生物信息学技术分析筛选出差异表达的mRNA-Egr2及其具有潜在相互作用的mi R-200a-3p。建立脑出血的在体和离体模型,观察mi R-200a-3p和Egr2的表达水平,并进一步探讨mi R-200a-3p通过Egr2对脑出血后血肿周围组织继发性炎性损伤的生物学调控作用,探索脑出血治疗的潜在靶点。方法:1.筛选目的mRNA和miRNA:建立小鼠脑出血模型,制备组织样本,用高通量测序技术构建测序文库;利用生物信息学技术对测序结果进行分析,筛选出差异表达的mRNA-Egr2及其具有潜在相互作用的mi R-200a-3p。2.离体实验:采用LPS刺激BV2细胞,选取最佳诱导浓度和时间,建立离体炎症损伤模型,检测mi R-200a-3p、Egr2的表达水平;利用细胞免疫荧光染色法,明确Egr2在BV2细胞中的亚细胞定位;通过瞬时转染mi R-200a-3p mimics或inhibitors,将其过表达或抑制,检测各组中Egr2及下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平变化;使用Target Scan数据库预测mi R-200a-3p和Egr2的结合位点,并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。3.在体实验:建立小鼠脑出血模型,于建模后第1、3、7天分别检测血肿周围脑组织mi R-200a-3p、Egr2的表达水平;通过侧脑室注射沉默mi R-200a-3p腺相关病毒,建立下调mi R-200a-3p的脑出血小鼠模型,检测Egr2及下游炎症因子的表达水平变化,并观察小鼠行为学、脑水肿等神经损伤改变情况。结果:1.高通量测序显示:在小鼠脑出血模型中有969个差异表达的mRNAs（545个下调,424个上调）,106个差异表达的miRNAs（55个下调,51个上调）,生物信息学技术分析筛选出显著下调的mRNA-Egr2和显著上调的mi R-200a-3p。2.离体实验显示:LPS浓度为1ug/ml时,BV2细胞活性最佳;当持续作用24h,培养上清液中TNF-α的表达水平达到峰值。与Control组相比,LPS组中mi R-200a-3p表达水平显著升高,而Egr2的表达水平显著降低。细胞免疫荧光结果显示Egr2主要表达于BV2细胞的胞核内。在BV2细胞中转染mi R-200a-3p mimics,Egr2的表达水平降低,IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平升高;转染mi R-200a-3p inhibitors,Egr2的表达水平升高,IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平降低。双荧光素酶报告基因实验显示,Egr2 mRNA的3′-UTR包含保守的mi R-200a-3p结合位点。3.在体实验显示:与Sham组相比,mi R-200a-3p的表达水平在脑出血后第1天显著升高,在随后的1周内逐渐降低;Egr2的表达水平在脑出血后第1天显著降低,在随后的1周内则逐渐升高。在脑出血小鼠侧脑室注射沉默mi R-200a-3p的腺相关病毒,下调其表达后可显著增加Egr2的表达水平,减少炎症因子的表达水平,并且减轻脑水肿程度,改善神经功能损伤。结论:小鼠脑出血后血肿周围组织中,高表达的mi R-200a-3p可能通过靶向抑制Egr2,促进小胶质细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α,加重了脑出血后的继发性神经炎性损伤。抑制mi R-200a-3p的表达可能通过减轻继发性神经炎性损伤,从而发挥神经保护作用。
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