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背景肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）为全球常见的恶性肿瘤之一,在肝癌细胞中存在着具有维持和促进肿瘤生长的细胞亚群,被称为肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）。近年发现microRNA在肿瘤的发生发展、细胞增殖和多向分化等过程中发挥了重要作用,尤其是let-7家族对于肿瘤干细胞的调控引起了越来越多的关注,我们前期研究发现let-7i在肝癌干细胞中显著升高,因此研究将针对let-7i对肝癌干细胞干性维持影响展开研究,并初步观察中药成分对let-7i的作用。目的探讨let-7i对肝癌干细胞干性维持的影响,以及初步探讨中药成分对let-7i的作用。方法1.肝癌组织及肝癌细胞球中let-7i的检测茎环RT-qPCR比较let-7i在肝癌和癌旁组织中的表达差异。运用无血清悬浮培养法将HepG2、SMMC7721肝癌细胞进行成球培养,比较let-7i在贴壁和成球细胞中的表达差异。2.let-7i体外对肝癌干细胞干性维持的影响首先,将let-7i mimic和let-7i inhibitor分别以50nM和100nM转染肝癌细胞24h,并用茎环RT-qPCR验证转染后肝癌细胞中let-7i的表达。接着,观察let-7i对肝癌干细胞干性维持的影响,包括:（1）Western blot检测肝癌干细胞分子标记CD133和EpCAM蛋白的表达;（2）运用成球实验、RT-qPCR检测干细胞基因、平板克隆、软琼脂克隆、细胞增殖实验方法,观察肝癌干细胞自我更新能力的变化;（3）RT-qPCR检测肝干细胞和成熟肝细胞基因表达,观察分化能力的变化;（4）运用MTT法检测细胞转染后对化疗药物耐药能力的变化;（5）运用划痕试验和Transwell侵袭试验检测侵袭转移能力的变化。3.let-7i对体内成瘤能力的影响将体外转染24h后的细胞按照1×105个/只接种到裸鼠皮下。（1）运用茎环RT-qPCR检测瘤组织中let-7i的表达;（2）观察裸鼠成瘤情况、瘤体积以及瘤重;（3）运用Western blot检测瘤组织中CD133和EpCAM蛋白表达。4.姜黄素和苦参碱对let-7i的作用用MTT法检测姜黄素和苦参碱对肝癌细胞的IC50值,再用茎环RT-qPCR法检测IC50浓度的姜黄素和苦参碱对let-7i表达的影响。结果1.let-7i在肝癌组织及肝癌细胞球中高表达与癌旁组织相比,let-7i在肝癌组织中的表达是癌旁组织的3.92±0.84倍,显著升高（p<0.05）。同时SMMC7721和HepG2成球细胞较贴壁细胞let-7i表达显著增高（p<0.05）,分别为贴壁细胞的3.92±0.73倍和7.07±0.37倍。2.let-7i体外能够维持肝癌的干性特征2.1建立let-7i上调/下调体系转染let-7i mimic,与对照组相比,SMMC7721和HepG2细胞中let-7i分别上调了5.02±0.68倍（P<0.01）和11.61±2.84倍（P<0.05）。转染let-7i inhibitor,与对照组相比,let-7i表达分别下降了57%±11%和62%±20%（P<0.05）,表明成功建立let-7i上调/下调体系。2.2 let-7i能增加肝癌细胞中CD133和EpCAM蛋白的表达与对照组相比,上调let-7i能显著增加SMMC7721和HepG2细胞中CD133和EpCAM蛋白的表达（P<0.05）。而下调let-7i则能显著降低SMMC7721和HepG2细胞中CD133和EpCAM蛋白的表达（P<0.05）。2.3 let-7i能增强肝癌的自我更新能力（1）成球能力:在SMMC7721和HepG2细胞中,与对照组相比,上调let-7i后肿瘤球的数量显著较多,体积增大,更加致密。下调let-7i后肿瘤球的数量显著减少,且体积变小,尤其是在SMMC7721细胞中,几乎没有肿瘤细胞球形成。（2）干细胞基因表达:在SMMC7721和HepG2细胞中,与对照组相比,上调let-7i能显著上调干细胞基因SOX2、Oct4、Nanog、Bmi1的表达（P<0.05）。与对照组相比,下调let-7i则能显著下调干细胞基因SOX2、Oct4、Nanog、Bmi1的表达（P<0.05）。（3）平板克隆形成能力:在SMMC7721和HepG2细胞中,与对照组比,上调let-7i后能形成的更大更多的克隆,其克隆数分别为对照组的1.44±0.02倍和1.58±0.10倍。与对照组比,下调let-7i所形成的克隆大小较小且数量较少,其中克隆数分别降低了58%±19%和65%±7.0%。（4）软琼脂克隆形成能力:在SMMC7721和HepG2细胞中,与对照组比,上调let-7i能形成更大、更多数目的克隆,克隆数增加分别是对照组的1.56±0.07倍和1.74±0.29倍。与对照组比,下调let-7i形成的克隆较小且个数较少,克隆数分别降低了44%±4.5%和43%±6.7%。（5）细胞增殖能力:在SMMC7721和HepG2细胞中,与对照组相比,上调let-7i能增加肿瘤细胞的增殖速度,尤其在第6天,SMMC7721细胞数呈极显著增加（P<0.01）,HepG2细胞则呈显著增加（P<0.05）。下调let-7i后SMMC7721和HepG2细胞数在第6天均被显著抑制（P<0.05）。2.4 let-7i能够促进肝癌细胞的分化能力与对照组相比,上调let-7i能显著升高肝干细胞基因CK-18、MYC、AFP的表达（P<0.05）,降低成熟肝细胞基因CYP3A4、G6P、ALB的表达（P<0.05）。下调let-7i则能显著降低肝干细胞基因CK-18、MYC、AFP的表达（P<0.05）,增加成熟肝细胞基因CYP3A4、G6P、ALB的表达（P<0.05）。2.5 let-7i能够增强肝癌细胞的耐药能力与对照组相比,上调let-7i后SMMC7721和HepG2细胞对5-FU和DOX表现出更强的耐药性（P<0.05）。与对照组相比,下调let-7i后SMMC7721和HepG2细胞对5-FU和DOX的耐药性均显著减弱（P<0.05）。2.6 let-7i能够增加肝癌细胞的迁移侵袭能力与对照组相比,上调let-7i后SMMC7721和HepG2细胞的迁移距离,以及穿过半透膜的细胞数均明显增加（P<0.05）。与对照组相比,下调let-7i细胞的迁移距离和穿过半透膜细胞数均明显减少（P<0.05）。3.let-7i能促进肝癌细胞体内成瘤能力体内试验结果表明:（1）茎环RT-qPCR结果显示,转染let-7i agomir后瘤内let-7i表达显著增加（P<0.05）,是对照组的3.57±0.87倍。（2）与对照组相比,上调let-7i能促进肿瘤的生长,能显著增加肿瘤的体积和瘤重（P<0.05）。（3）Western blot结果显示,与对照组相比,上调let-7i能够显著增加瘤内CD133和EpCAM的表达（P<0.05）,其中CD133较对照组增加了1.40±0.11倍,而EpCAM增加更为显著达到2.88±0.21倍。4.姜黄素和苦参碱对let-7i的作用在SMMC7721和HepG2细胞中,与对照组相比,姜黄素能显著降低let-7i的表达（P<0.05）,而苦参碱显著升高let-7i的表达（P<0.05）。结论肝癌组织和成球细胞中均高表达let-7i,let-7i体外和体内都能够维持肝癌干细胞干性特征,同时姜黄素能下调let-7i的表达,苦参碱能上调let-7i的表达。这一结果将有利于揭示肿瘤干细胞干性维持的机制,发现新的针对肿瘤干细胞的药物。