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由副猪嗜血杆菌(Haemophlius parasuis, HPS)引起的Glasser’s’病已经给全球养猪业造成重大损失。铁几乎是所有生物体不可或缺的微量营养元素,它可以作为多种生物过程的电子受体或供体发挥作用。血红素是细菌重要的铁源之一,由hxuCBA基因簇组成的hxu血红素摄取系统是副猪嗜血杆菌获取铁源的途径之一。本文通过对组成该系统的三个基因进行克隆表达,并分别对表达产物进行了生物信息学分析、免疫原性、免疫保护性、抗血清杀菌等研究。主要研究结果如下：1.HPS hxuCBA基因簇的克隆、鉴定及分析针对HPS hxuC、hxuB、hxuA基因(组成hxu血红素摄取系统的基因)分别设计一对引物(各基因片段中信号肽序列已去除),基因片段大小分别为2064bp、 1617bp、2847bp。通过PCR的方法从HPS四川M-3分离株的基因组中扩增得到hxuC、hxuB、hxuA基因,分别构建pMD19-T-C、pMD19-T-B、pMD19-T-A重组克隆质粒,三种质粒经测序鉴定显示突变碱基未形成终止密码子,与HPS SH0165菌株的核苷酸序列一致性分别达99.22%、99.13%、98.11%,hxuC和hxuB基因序列无碱基缺失,hxuA基因序列有6个碱基缺失。对HPS HxuC、HxuB、HxuA氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示HxuC、HxuB、HxuA成熟期蛋白分别由688、539、949个氨基酸组成,蛋白大小分别为78.07kDa、60.72kDa、105.72kDa,等电点分别为9.23、9.34、6.36,均无跨膜区存在。三种蛋白的二级结构均由无规则卷曲(30.81%、30.80%、38.78%)、延伸链(19.48%、28.76%、29.08%)、α螺旋(40.55%、28.57%、22.13%)和p转角(9.16%、11.87%、10.01%)组成。HxuC口HxuB属于外膜蛋白,HxuA属于胞外蛋白。通过功能位点预测分析,三种蛋白均含有多个糖基化、磷酸化位点,另外HxuC、HxuB、HxuA分别含有1个TonB依赖受体蛋白信号2位点、1个ATP/GTP结合位点基序A(P环)、1个内质网定位序列。抗原表位分析显示HxuC、HxuB、HxuA蛋白均含有多个抗原决定簇位点,并且分别有30、20、38个与细胞毒性T细胞结合的抗原表位位点。同时对HxuC进行同源建模,发现HxuC蛋白在同种间同源性很高,而在同属与同科间同源性很低。2. HPS hxuCBA基因簇的表达及纯化利用BamHI和Ncol对pMD19-T-C、pMD19-T-B、pMD19-T-A和pET39b进行双酶切,16℃进行连接,构建pET39-C、pET39-B、pET39-A重组表达质粒,将重组表达质粒转入E.coil(BL21)表达菌内进行诱导表达。优化蛋白表达条件的结果显示,HxuC经37℃,0.2 mmol/L IPT G浓度诱导6 h达到最大表达量,HxuB经37℃,1.2mmol/L IPTG浓度诱导3 h达到最大表达量,HxuA在30℃,IPTG诱导浓度0.8mmol/L诱导2 h表达量最大。经SDS-PAGE显示三种重组蛋白均可以可溶性和包涵体形式存在,分子量大约为105kDa、87kDa、130 kDa(含载体部分)。然后通过镍离子亲和层析法纯化得到目的蛋白,纯化的蛋白经透析后进行western-blot结果表明三种蛋白均具有良好的反应原性。3.HPS HxuC、HxuB、HxuA蛋白的免疫特性研究以昆明小鼠作为实验动物,用自制的HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA (包含HxuC、 HxuB、HxuA)疫苗和HPS M-3全菌灭活苗进行皮下注射免疫。一免后第14天进行二免。一免和二免分别用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。并分别用佐剂和PBS作为对照。每次免疫后7天对小鼠进行断尾收集血清。通过ELISA的方法检测抗体水平和细胞因子水平,结果显示小鼠抗1HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3血清的抗体效价分别达到1：6400、1：3200、1：1600、1：12800、1：12800；相比于免疫前,细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平均有所升高,而且一免和二免结果呈现递增趋势。本研究进行了抗血清杀菌实验,结果显示HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3、佐剂、PBS组的细菌存活率分别为28.2%、32.3%、38.6%、35.1%、28.5%、46.9%、48.3%。由此可见,HxuC、HxuB、HxuCBA 对 HPS M-3有明显的抗菌作用,而HxuA的抗菌作用相对较弱。以昆明小鼠作为实验动物,测出HPS M-3菌株的半数致死量LD50,约为1.3×109cfu。随后进行了攻毒保护试验,免疫程序同上。另外设立全菌灭活免疫组。二免后第7天对小鼠进行腹腔攻毒(5×LD50),攻毒后统计小鼠发病死亡状况。结果显示PBS对照组和佐剂对照组小鼠全部死亡,HxuC、HxuB、HxuA、 HxuCBA、M-3免疫组保护率为87.5%、62.5%、37.5%、75.0%、87.5%。另外,这三种蛋白均能减少副猪嗜血杆菌对小鼠的组织损伤。这些研究表明HxuC、HxuB、 HxuCBA可作为亚单位疫苗的有效候选蛋白。