分枝杆菌属包括结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌等,目前仍是危害公共健康的重要致病菌。据统计,2018年全球约有150万人死于结核病,并且约有1000万患者新发结核病。因此,对分枝杆菌进行遗传操作来了解其致病及耐药基因,进而了解相关机制,对于治疗分枝杆菌引起的疾病十分重要。然而由于分枝杆菌生缓慢,且缺乏有效的遗传操作工具构建点突变及基因敲除的菌株,这严重约束了对分枝杆菌的生物学研究。单碱基编辑是基因编辑的一种形式,它可以在不干扰其他碱基序列的情况下,直接将目标基因位点上的一个碱基转化为另一碱基,该过程无需DNA双链断裂,也无需非同源末端连接等其他修复方式的参与。在本研究中,我们将腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶分别与剪切活性受损的Cas9蛋白连接构成融合蛋白,克隆至载体中构建成单碱基编辑器,由此可以实现腺嘌呤碱基编辑器介导的基因组碱基A至G的转换,或胞嘧啶碱基编辑器介导的基因组碱基C至T的转换。并利用碱基编辑器成功在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌基因组中实现了单碱基编辑,实现了 A:T与C:G碱基对的互换。并进一步发现在分枝杆菌中,与修复作用相关的RecA蛋白与NucS蛋白影响单碱基编辑的发生,抑制其功能时,可以提高单碱基编辑的效率。综上,利用单碱基编辑器,可以在分枝杆菌中实现精准基因编辑,以及快速高效构建无痕突变和基因敲除的菌株。下一步我们将对此系统进行优化,由此提高对结核分枝杆菌单碱基编辑的效率。这将促进结核分枝杆菌致病和耐药机制的研究,为结核病的防治提供可靠支持。