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[目的] 目前临床上用于治疗流感病毒感染的药物，存在耐药性、神经毒性以及胃肠道毒副作用等缺陷，急需发展新型抗流感病毒药物，以解决目前面临的流感防治问题。本实验拟从传统中药材黄连中提取具有抗流感病毒活性的组分，并对其作用机制进行初步探讨。 [方法] 1.黄连成分提取。粉碎药材，精确称量100 g，加2 L95％乙醇，60℃浸泡2h，超声波40 Khz处理30 min;80℃回流提取两次，浓缩，过滤储存于-20℃。 2.黄连提取物的细胞毒性分析。24孔板接种1.5×104个MDCK细胞/孔，5％CO2、37℃培养箱中培养24 h。加入不同浓度的黄连提取物（设置7个浓度，每个浓度3个复孔），以不加药的细胞为对照组，逐日观察细胞状态，记录结果。 3.黄连提取物的抗病毒活性分析。24孔板接种1.5×104个MDCK细胞/孔，5％CO2、37℃培养箱中培养24 h。加100倍TCID病毒吸附3h，在无毒浓度范围选取4个浓度（2、1.5、1、0.5 mg/ml）加入板中（3个复孔），逐日观察细胞状态，记录结果。 4.CCK-8测定黄连提取物抗病毒活性。96孔板接种3000个MDCK细胞/孔，5％ CO2、37℃培养箱中培养24 h。加100倍TCID50病毒吸附细胞3h后去除病毒，并将黄连提取物稀释成10个浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2 mg/ml)加到96孔板中（3个复孔），以加入病毒不加药物、不加病毒不加药物和空白DMEM培养基为对照组。5％CO2、37℃培养箱中培养36h后加CCK-8试剂检测吸光度值，计算MDCK细胞存活率。 5.黄连提取物对病毒感染细胞的影响。将6孔板接种6×104个MDCK细胞/孔，培养24 h后用LipofectamineTM2000转染Gluc质粒，培养24 h后消化计数，将细胞接种到96孔板中（3000细胞/孔），培养24 h。加100倍TCID50的病毒吸附细胞3h，之后去除病毒液，将黄连提取物稀释成4个浓度(2、1.5、1、0.5 mg/ml)加到96孔板中（每个浓度4个复孔），以转染pcDNA3.1质粒为对照组，培养36 h后，取上清加荧光素酶底物检测吸光度值，计算相对荧光强度。 6.检测黄连提取物的抗病毒活性是否以RNA聚合酶为靶点。24孔板接种293T细胞（9×104个细胞/孔），培养24 h后转染五质粒（表达RdRp的4个质粒和表达荧光素酶的质粒Rluc）;培养24 h后将不同浓度的黄连提取物(2、1.5、1、0.5 mg/ml)加入96孔板中（每个浓度4个复孔），同时以转染pcDNA3.1质粒为对照组，培养36 h后裂解细胞，加入荧光素酶底物检测吸光度值，计算相对荧光强度。 7.黄连提取物的分离纯化。使用300目层析硅胶填柱，将甲醇溶解的黄连提取物加相同体积的硅胶，旋转蒸发至干粉状，使样品吸附到硅胶上，平衡30 min后，以氯仿∶甲醇∶冰醋酸=7∶1∶2为流动相洗脱，收集不同条带。 8.纯化组分的HPLC分离。采用Agilent TC-C18柱(4.6×250 mm，5μm)，柱温25℃，检测波长354 nm，上样体积20μl，用磷酸二氢钾∶乙腈(95∶5)作为流动相，流速0.8 ml/min，收集不同组分。 [结果] 1.药物通过95％乙醇浸泡，索氏提取装置两次回流提取后旋转蒸发，烘干至浸膏后，使用20 ml DMSO溶解得到1000 mg/ml的黄连粗提物。 2.与对照组相比，实验组中浓度＞2 mg/ml的药物组，细胞状况发生明显病变，细胞大部分脱落，浓度=2 mg/ml的实验组，细胞状态良好，所以药物的无毒浓度范围为=2 mg/ml。 3.细胞感染病毒之后，加入不同浓度药物(0.5、1、1.5、2 mg/ml)，与对照组相比，2 mg/ml的细胞状态最好，具有较明显的抗病毒活性，随着药物浓度的增加，细胞脱落程度逐渐降低，说明黄连提取物具有抗病毒活性并存在浓度依赖性。 4.CCK-8实验结果显示，病毒对照组存活率为(20.0±3.1)％，不同浓度药物对细胞存活率的影响如下:0.2 mg/ml细胞存活率为(63.1±1.7)％，与病毒对照相比，存活率提高2.1倍;0.4 mg/ml细胞存活率为(74.6±1.7)％，提高2.7倍;0.6 mg/ml细胞存活率为(81.2±3.4)％，提高3倍;0.8 mg/ml细胞存活率为(83.8±1.1)％，提高3.1倍:1 mg/ml细胞存活率为(88.5±7.9)％，提高3.4倍;1.2 mg/ml细胞存活率为(89.8±2.5)％，提高3.5倍;1.4 mg/ml细胞存活率为(95.0±1.9)％，提高3.7倍;1.6 mg/ml细胞存活率为(95.5±2.2)％，提高3.8倍;1.8 mg/ml细胞存活率为(96.0±3.8)％，提高3.8倍;2 mg/ml细胞存活率为(105.9±2.2)％，提高4.3倍;5 mg/ml细胞存活率为(54.5±0.5)％，提高1.7倍％;以上结果差异均有统计学意义(P＜0.01)。说明药物具有抗病毒活性。10 mg/ml细胞存活率为(11.9±0.4)％，降低40.5％;15 mg/ml细胞存活率为(0.3±0.1)％，降低98.7％;差异均有统计学意义(P＜0.01)。 5.Gluc实验结果显示，黄连提取物浓度为2 mg/ml实验组相对荧光素酶活性为（1.0±0.2）％，与病毒对照组(100％)相比，下降了99％;浓度为1.5 mg/ml实验组相对荧光素酶活性为（1.81±0.61）％，下降98.19％;浓度为1 mg/m实验组相对荧光素酶活性为（49.5±1.1）％，下降50.5％;浓度为0.5 mg/ml实验组相对荧光素酶活性为(55.75±5.0)％，下降44.25％，以上结果差异具有统计学意义（P＜O.01）光因此，黄连提取物能够降低病毒感染后细胞内Gluc质粒表达荧光素酶的能力，具有明显的的抗病毒活性。 6.五质粒转染实验结果显示，与阳性对照(100％)相比，黄连提取物浓度为2 mg/ml实验组相对荧光强度为（13.41.12）％，下降86.6％;1.5 mg/ml相对荧光强度为（19.6±1.15）％，下降80.4％;1 mg/ml相对荧光强度为（50.8±1.70）％，下降49.2％;0.5 mg/ml相对荧光强度为(69.6±6.93)％,下降30.4％;以上结果差异具有统计学意义(P＜0.01)，提示黄连提取物抗病毒机制可能以RdRp为靶点。 7.将黄连提取物通过300目硅胶柱层析分离后得到4个纯化成分，通过抗病毒活性分析证实第三个组分具有抗病毒活性，最后通过HPLC，磷酸二氢钾∶乙腈(95∶5)为流动相分离纯化物质。 [结论] 本实验通过传统的药物提取方式提取黄连的粗提物，并对其进行初步分离纯化后，证明其对流感病毒具有抑制作用。对其作用机制的初步研究表明，黄连提取物发挥抗病毒活性可能通过抑制流感病毒的RNA聚合酶活性来实现。