Ran是Ras超家族的一个小GTP酶,在多个细胞生理过程中发挥重要的功能,例如,大分子的核质转运,有丝分裂中纺锤体的形成以及有丝分裂末期核膜的形成。Mog1(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG)是一个近来发现的Ran结合蛋白,体外研究表明Mog1可以促进Ran释放其结合的GTP和GDP,但是并不清楚它的释放机理及其生物学意义。因而获得原子分辩率的复合物结构很有必要,尽管Ran的晶体结构多年前已被解析,但想要获得Mog1和Ran复合物的结构还是个很大的挑战,源于这两个蛋白质的动力学特征以及复合物有多处柔性区域,例如Ran的switch I,II区域与不同蛋白结合后往往会有变构效应,另外Mog1存在几处非常大的loop,而核磁共振(NMR)技术是研究蛋白质动力学和构象变化的有力手段。几年前我们实验室的胡琦博士和刘迎博士克隆表达纯化并用NMR方法成功解析了人的Mog1(hMog1)的溶液结构,为我们进一步探索47KD的Mog1和Ran复合物的结构和功能打下了良好基础。在此,我们综合运用了多种核磁方法来研究Mog1和Ran蛋白质复合物的结构。首先,化学位移扰动实验结果表明Mog1与Ran结合表现为明显的慢交换,许多单体峰的强度逐渐减弱至消失,同时伴随着在其它地方新峰的出现,因而无法一一追踪化学位移的变化,这意味着复合物状态下需要重新指认化学位移。这一尺寸下的蛋白常规三共振实验需要全氘代样品,涉及蛋白质的变复性,样品只能在270C下稳定,然而相应的核磁谱图质量很差,无法进行常规的序列指认。为了克服NMR研究蛋白质的分子量的限制,我们采用了甲基选择性标记的技术,通过分子内NOE网络和点突变的方法指认了复合物状态下Mog1和Ran的大部分ILV的甲基;利用13C edited NOESY-HMQC谱,比较间接维1H演化时15N-去耦和不去耦实验,确定界面上的甲基基团。同时借助甲基-甲基的分子间NOE,获得了更为精细的复合物界面结构信息。综合顺磁弛豫增强(PRE)和残留偶极耦合(RDC)数据得到了复合物的长程约束和两个蛋白的相对取向信息,最终借助Haddock软件搭建了复合物的结构模型,并通过分子动力学模拟优化了结构模型。从结构模型出发,我们找到了几个影响相互作用的关键残基,并通过定点突变方法结合胞外胞内实验证实了这几个关键残基确实影响了 Mog1和Ran相互作用。酶活实验证实了 hMog1在胞外是Ran的核苷释放因子,复合物的结构模型提出了一种可能的释放机制,为后面的功能研究指引了方向。功能方面的研究与刘恒合作进行(功能方面研究详见刘恒博士论文),结果表明,在正常细胞的有丝分裂期,Mog1维持了 RanGTP的浓度在一个恰当的水平,从而保证了有丝分裂的正常进行。