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本试验观察靛玉红对肺癌的抑制作用，及与凋亡诱导剂SM-406联合用药时对肺癌细胞的增殖抑制以及诱导调亡的协同作用，并进一步进行作用机制方面的探讨。
实验方法
1.采用WST(CCK-8)法检测靛玉红和SM-406单药及两者联合对于15种肺癌细胞株的增殖抑制作用，筛选出敏感细胞进行下一步的实验研究；
2.台盼兰染色法观靛玉红和SM-406单药及联合用药对肺癌细胞H522和H1299作用不同时间后活力的影响；
3. DAPI荧光染色法观察靛玉红和SM-406单药及联合用药对肺癌细胞H522和H1299作用不同时间后的变化及凋亡发生情况，并进行计数作对比；
4. FCM-PI单染法检测靛玉红和SM-406单药及联合用药肺癌细胞H522和H1299作用不同时间后周期以及凋亡的变化情况，明确两种药物的作用途径以及它们的作用特点；
5.蛋白质印迹法(Western blot)观察靛玉红和SM-406单药及联合用药作用肺癌细胞H522和H1299后，周期相关蛋白CDK4和CDK6等的表达及凋亡相关蛋白XIAP、Caspase-9和Caspase-3等的表达情况。
6.体内建立肺癌细胞H522和H1299的裸鼠异种移植肿瘤模型，观察药物对肿瘤生长的影响。H522肺癌细胞移植模型用靛玉红(60mg/kg，连续灌胃给药5周)、SM-406(100mg/kg连续灌胃给药5周)或联合给药5周；H1299肺癌细胞移植模型用靛玉红(60mg/kg，连续灌胃给药3周)、SM-406(30和100mg/kg连续灌胃3周)或联合给药(靛玉红60mg/kg联合SM-40630mg/kg，连续灌胃3周)。观察单独给药与联合给药后对肿瘤的抑瘤作用，每周两次用游标卡尺测量肿瘤体积，并进行数据统计处理。实验结束后，处死裸鼠，取肝脏等重要脏器，HE染色观察脏器的病理情况。
实验结果
1. SM-406对人非小细胞肺癌株A549、NCI-H522、NCI-H1299、Hop62、Hop92、NCI-H1437、NCI-H1975和EKVX的IC50值分别为:24.8±30.61、2.36±3.00、18.53±16.67、42.53±21.07、56.75±13.50、68.81±75.57、88.56±16.19和55.44±4.58，其它细胞IC50均大于100μM。靛玉红对人非小细胞肺癌株NCI-H522、A549、NCI-H1299、NCI-H292和NCI-H661五种细胞的IC50值分别为:22.37±2.40、46.28±3.68、26.90±7.25、19.65±1.15、45.59±16.74，其它细胞IC50均大于100μM。其中对靛玉红和SM-406都敏感的有H522、A549和H1299。在单药有效的基础上观察联合给药是否具有协同作用，我们选择H522、A549和H1299肺癌细胞株进行联合用药的协同作用研究。结果显示靛玉红联合SM-406在一定浓度作用于H522和H1299细胞，抑制率达到50％、70％和90％时CI系数均小于1，表明靛玉红联合SM-406对人非小细胞肺癌细胞株H522和H1299均具有协同增殖抑制作用。对A549细胞增殖没有协同抑制作用。
2.台盼兰染色计数显示一定浓度的靛玉红联合SM-406可以促进H522和H1299肺癌细胞的死亡，在光学显微镜下可以看到细胞形态以及数目发生的变化。H522细胞表现为:靛玉红组细胞数目减少，体积增大，细胞轮廓变得模糊；SM-406组细胞出现空泡样变化，贴壁细胞数目也减少；联合给药组基本没有细胞贴壁，细胞形态空泡现象更加明显。H1299细胞表现为靛玉红与SM-406组细胞均出现蜘蛛网状结构，细胞形态变的细长，联合给药组细胞数目少，体积增大。
3.荧光显微镜观察DAPI染色后的细胞核，发现SM-406与靛玉红分别单独及联合作用于人肺癌细胞株H522和H1299，6h、12h、24h、48h和72h后，可以观察到胞核亮染、核固缩和核碎裂的凋亡细胞，本实验中发现靛玉红联合SM-406引起细胞形态的变化除了有典型的凋亡形态外，同时还出现明显的细胞核体积增大，或细胞核不规则型，推测可能是靛玉红抑制细胞周期进程，影响染色质的复制过程，因此细胞核的形态发生变化。
4.流式仪检测分析结果显示靛玉红对肺癌细胞H522有明显的剂量依赖性的G0/G1期阻滞作用，其中在靛玉红80μM时，阻滞效果最为明显，48h G0/G1期DNA含量达到了80.96％。而SM-406对H522有轻微的S期阻滞的作用，但有很强的诱导sub-G0期作用，表现为凋亡细胞率增加明显，并有明显的时效关系。两药联合周期阻滞作用不明显，但随着作用时间的延长，增强诱导细胞凋亡的作用。
5. Western blot结果显示
5.1在H522细胞，SM-406对XIAP和clAP-2的抑制作用不明显，但对cIAP-1则表现抑制作用，并可促进Procaspase-9，Procaspase-7和Procaspase-3的裂解。靛玉红80μM可明显抑制CDK6和CDK2的表达，并抑制Rb的磷酸化。结果还表明SM-406对细胞周期素依赖激酶CDK4表现剂量依赖性的抑制作用，而靛玉红则对XIAP表现明显的抑制作用。联合用药时对CDK2、CDK6、pRb、XIAP、Procaspase-9、Procaspase-7和Procaspase-3蛋白表达的抑制作用与单药组比较差异明显。
5.2 SM-406对H1299细胞的XIAP、clAP-1和cIAP-2均表现抑制作用，对Procaspase-9和Procaspase-3表达有一定的抑制作用。靛玉红抑制CDK6表达，同时增强周期素依赖激酶抑制蛋白P21的表达，最终抑制Rb的磷酸化，并呈现一定的量效关系。此外SM-406对CDK4和CDK6蛋白的表达也表现明显的抑制作用。在联合给药时对CDK6和pRb的抑制作用比单药明显，对XIAP和clAP-2，以及Procaspase-9、Procaspase-7和Procaspase-3蛋白的表达抑制作用也比单药明显；联合用药还可增强P21的表达并促进Cleaved-Caspase-9的表达，与单药组比较有明显差异。
6.在裸鼠异种移植人肺癌模型试验中，SM-406-30mg/kg/day和100mg/kg/day两种不同浓度对H522异种移植模型均有抑制作用，其相对肿瘤增殖率(T/C％)分别为69.73％、41.92％；靛玉红60mg/kg/day组相对肿瘤增殖率为85.98％，对H522抑制作用不明显。阳性对照药TXT8mg/kg组可以抑制肿瘤生长，其相对肿瘤增殖率为43.71％。靛玉红与SM-406联合用药时的相对肿瘤增殖率为35.23％，与模型组相比有显著性差异；与SM-406和靛玉红单药组以及TXT组比较，联合抑制H522肿瘤生长作用均比较强。
对H1299移植瘤，SM-406-100mg/kg/day组相对肿瘤增殖率(T/C％)为40.43％，靛玉红60mg/kg/day组相对肿瘤增殖率为83.54％，TXT8mg/kg组相对肿瘤增殖率为43.80％。靛玉红联合SM-406时，其相对肿瘤增殖率为32.06％，与模型组相比差异显著，与靛玉红和SM-406单药组比较抑制作用明显，其抑制作用优于阳性药TXT组。两药联合对肿瘤的抑制作用比单独用药效果好。
体内试验期间，靛玉红单独给药组裸小鼠一般状态良好，外观、毛色、活动及进食、饮水和粪便等均无明显变化，SM-406给药组体重增加有所减缓，联合用药对裸鼠体重增加有一定影响，但在给药结束后均恢复正常，石蜡切片HE染色观察两种药物联合应用后，各组裸鼠重要脏器的变化，镜下均未见病理性改变。
实验结论
1.靛玉红和SM-406单药对体外培养的肺癌细胞有良好的抑制作用。联合用药时对H522和H1299的生长具有协同抑制作用，并协同诱导细胞死亡和凋亡。
2.体内试验结果表明，靛玉红单药对肺癌H1299和H522移植瘤的抑制作用有限，SM-406单药则具有良好的抑制作用，而且在与靛玉红联合用药时，抑制肿瘤生长的作用明显加强。
3.靛玉红通过下调细胞周期相关蛋白CDK6或增强P21的表达，从而抑制Rb的磷酸化，造成细胞周期阻滞在G0/G1期。而SM-406通过抑制XIAP、c-IAP-1或c-IAP-2的表达并促进caspase-9，Caspase-7和Caspase-3的裂解活化，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。结果还表明，SM-406对H522细胞CDK4有明显的抑制作用，而靛玉红则对XIAP的表达也表现抑制作用，提示两者联合使用时表现的协同作用可能是通过共同影响细胞周期进程和诱导凋亡实现的。