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第一部分Pard3在胃癌组织中的表达及临床病理学意义目的:研究胃癌组织和癌旁组织中Pard3表达水平,并结合临床数据,综合分析Pard3表达水平与胃癌临床病理学特点之间的相关性。方法:收集武汉协和医院胃肠外科2016年-2018年行手术治疗的胃癌标本35例(包括胃癌组织和癌旁组织)借助RT-PCR,Western Blot,及免疫组化技术检测Pard3在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况,并结合临床数据,深入分析Pard3的表达量与病人年龄,性别,TNM分期及肿瘤组织分化情况的相关性。结果:免疫组化实验的结果显示:同癌旁正常黏膜组织相比较,胃癌组织中Pard3的表达量明显降低(P<0.01)。RT-PCR和Western Blot的结果显示:Pard3在肿瘤组织中表达量明显低于癌旁组织(P<0.01)。临床病理学特征相关性分析结果显示:Pard3的表达下调与病人的T分期和N分期相关(P<0.05),而与肿瘤分化情况,年龄和性别无明显的统计学相关性(P>0.05)。结论:1、Pard3在胃癌组织中的表达量明显低于癌旁黏膜组织。2、Pard3的表达量与肿瘤的T分期和N分期具有相关性。第二部分Pard3沉默对胃癌细胞恶性生物学行为的影响目的:研究极性蛋白Pard3沉默对胃癌细胞迁移、侵袭以及肺转移瘤形成能力的影响方法:借助慢病毒载体的sh-Pard3转染胃癌细胞系SGC7901细胞和HGC27细胞,建立稳定转染的Pard3沉默的细胞株用于随后的实验。借助划痕实验,Transwell实验,侵袭实验及裸鼠的肺转移瘤形成实验等实验技术,研究Pard3沉默对胃癌细胞迁移,侵袭和肺转移瘤形成能力的影响。结果:Western blot实验结果显示:Pard3在正常胃粘膜上皮细胞系GES1中的表达量高于胃癌细胞系AGS细胞,MGC-803细胞,BGC-823细胞,MKN45细胞,SGC7901细胞和HGC27细胞。sh-Pard3可以明显敲低Pard3 m RNA和蛋白的表达量(P<0.01)。划痕实验,Transwell实验的结果表明Pard3的表达降低可以明显增强胃癌细胞的迁移能力(P<0.05)。侵袭实验结果显示:Pard3的表达降低能够显著增强胃癌细胞的侵袭能力(P<0.05)。裸鼠肺转移瘤形成实验结果表明:Pard3沉默促进肺转移瘤的形成(P<0.05)。结论:Pard3沉默能够促进胃癌细胞的迁移,侵袭和肺转移瘤形成。第三部分Pard3沉默通过激活NFκB通路调控胃癌细胞迁移和侵袭能力的机制研究目的:探究Pard3沉默影响胃癌细胞迁移和侵袭能力的机制。方法:利用慢病毒载体sh-Pard3稳定转染的SGC7901细胞和HGC27细胞借助Western Blot,RT-PCR实验技术研究Pard3沉默对Snail,Zeb1,Zeb2,slug,N-cadherin,Vimentin和E-cadherin等上皮-间质转化过程中关键的转录因子和重要指标的影响。利用转录组测序技术,筛选出Pard3沉默影响的下游基因。并使用Western Blot,RT-PCR检测Pard3沉默对NFκB通路的影响以及Amotl2,Zo-1,Myh9表达变化。利用数据库预测NFκB/p-65与Amotl2启动子的潜在结合位点。并利用Ch Ip实验验证p-65结合Amotl2启动子的情况。此外,我们还使用免疫荧光技术检测了NFκB/p-65的核转位情况及细胞紧密连接蛋白Zo-1的变化。结果:在胃癌细胞系里Pard3的沉默对波形蛋白,E-cadherin和N-cadherin等EMT的重要指标分子以及Zeb1,Zeb2,slug等关键的转录因子的表达没有明显影响(P>0.05)。Pard3沉默可以促进Amotl2和Myh9的表达(P<0.05),降低细胞紧密连接相关蛋白Zo-1的表达(P<0.01)。Pard3沉默可以激活NFκB通路,促进NFκB/p-65的核转位(P<0.05)。利用NFκB通路抑制剂(PDTC)不仅可以明显抑制NFκB/p-65的核转位(P<0.05),还能够逆转Pard3沉默引起的Amotl2(P<0.01),Myh9表达增高(P<0.05)和Zo-1的表达下降(P<0.01)。在功能实验中NFκB通路抑制剂削弱Pard3沉默引起的迁移和侵袭能力增强(P<0.05)。免疫荧光实验结果显示:Pard3沉默明显促进胃癌细胞中NFκB/p-65的核转位,PDTC可以明显抑制Pard3沉默引起的NFκB/p-65的核转位。Pard3沉默抑制了胃癌细胞Zo-1的表达,而PDTC可以削弱Pard3对Zo-1的抑制。结论:1、Pard3沉默促进胃癌细胞迁移和侵袭不依赖EMT通路。2、Pard3沉默促进胃癌细胞迁移和侵袭通过激活NFκB通路实现的。3、Pard3沉默通过激活NFκB通路上调Amotl2,MYH9表达,下调Zo-1的表达。4、Pard3沉默激活NFκB通路促进Amotl2的转录来上调Amotl2的表达。5、在Pard3沉默的细胞中,NFκB通路可以调控Myh9蛋白水平,但是不影响m RNA水平。第四部分Pard3沉默通过Amotl2调控胃癌细胞迁移和侵袭能力的机制研究目的:探索Pard3沉默促进胃癌细胞迁移和侵袭的机制。方法:我们使用si-Amotl2 RNA敲低Pard3沉默细胞中的Amotl2的表达量,并借助RT-PCR,Western Blot以及蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)检测下游基因Zo-1和Myh9的表达变化。然后使用划痕实验,Transwell实验和侵袭实验来进一步研究Amotl2基因对Pard3沉默导致胃癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。利用免疫光技术检测Pard3和Amotl2共沉默对细胞之间紧密连接的影响。结果:在胃癌细胞,Pard3沉默可以上调Amotl2的表达(P<0.05)。在功能实验中,敲除Amotl2可以明显削弱Pard3沉默引起的胃癌细胞迁移和侵袭(P<0.05)。Western blot和RT-PCR结果显示:敲除Amotl2的表达可以削弱Pard3沉默导致的Myh9的上调(P<0.01)和Zo-1的下调(P<0.05)。蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)结果显示:Amotl2可以和Myh9形成复合物。免疫荧光的结果显示:敲除Amotl2后可以部分恢复Pard3沉默导致的紧密连接缺失。结论:1、Pard3沉默通过上调Amotl2来增强胃癌细胞迁移和侵袭能力。2、Pard3沉默通过上调Amotl2来调控Myh9和Zo-1表达的影响。3、Pard3,Amotl2以及NFκB通路可以调控Myh9蛋白的表达但是对m RNA水平没有明显的影响。Amotl2和Mhy9结合形成复合物。