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目的以BCR-ABL1激酶为靶点的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）在慢性髓性白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）的治疗中是显著有效的,但是仍有部分患者存在TKIs耐药,而这种耐药的潜在分子机制仍不完全清楚。有研究报道,micro RNA-21（miR-21）作为一种致癌micro RNA在肿瘤耐药中发挥重要作用,但其与CML中TKIs耐药的关系鲜有报道。作为一种新型高效的基因编辑工具,规律成簇的间隔短回文重复/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9）技术在完全敲除（knock out,KO）目标基因方面具有一定的优势。本课题旨在:1、应用CRISPR/Cas9技术在人CML细胞株K562及其耐伊马替尼（Imatinib,IM）耐药株KG中敲除miR-21基因,构建miR-21基因敲除的单细胞克隆,探讨CRISPR/Cas9在血液肿瘤细胞株中敲除micro RNA基因的有效性。2、研究miR-21基因敲除对K562及KG细胞增殖、药物敏感性等的影响,初步探讨miR-21基因敲除后CML细胞对TKIs敏感性变化的可能机制。方法1.根据人miR-21基因组序列,设计sg RNA靶点序列,构建相应的sg RNA表达载体,包装慢病毒。2.将其分别转染人CML细胞株K562及其耐IM耐药株KG;Surveyor核酸内切酶检测突变效率。3.聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）筛选转染后细胞所形成的单细胞克隆。4.RQ-PCR、Sanger测序进一步验证miR-21基因的敲除。5.应用MTT法和细胞克隆形成实验检测miR-21基因敲除对K562、KG细胞增殖的影响。应用MTT法和Annexin V-APC/7-AAD双染流式细胞检测法检测miR-21基因敲除后K562、KG细胞对TKIs敏感性的变化。6.Western blot法检测P210BCR-ABL、磷酸化P210BCR-ABL(P-P210BCR-ABL)以及PTEN/AKT/PI3K信号通路的变化。结果1.成功构建靶向人类miR-21基因敲除的慢病毒LV-VMP1-sg RNA（045001）。2.Surveyor突变检测结果显示我们所构建的慢病毒LV-VMP1-sg RNA（045001）能特异地靶向编辑人基因组DNA,在K562、KG细胞中其介导的突变率分别为2.16-21.88%和7.12-8.11%。3.通过单细胞克隆培养、PCR法筛选及Sanger测序鉴定,K562及KG细胞中各获得3个带有miR-21基因片段缺失的克隆,RQ-PCR检测这些单细胞克隆中成熟miR-21的表达水平,结果显示:K562#1、#2、#5单细胞克隆的miR-21表达量分别相当于野生型（wild type,WT）细胞的13.89±6.32%、26.23±14.36%、0.03±0.04%;KG 1#、2#、6#单细胞克隆的miR-21表达量分别相当于WT细胞的15.54±3.12%、0.26±0.15%、18.97±6.87%。4.miR-21基因敲除后抑制了K562及KG细胞的增殖,细胞克隆形成能力减弱。K562细胞的WT和miR-21敲除的1#、2#、5#单细胞克隆的克隆形成率依次为73.94%±3.15%和32.39%±3.69%、23.52±1.72%、41.11±2.05%,差异有统计学意义（P﹤0.05）。KG细胞的WT和miR-21敲除的1#、2#、6#单细胞克隆的克隆形成率依次为57.67%±8.25%和26.94%±5.36%、7.17±2.11%、31.50±3.65%,差异有统计学意义（P﹤0.05）。5.miR-21基因敲除后,K562细胞对达沙替尼以及KG细胞对伊马替尼、达沙替尼的敏感性均有所提高,而K562细胞对伊马替尼的敏感性未见明显改变。miR-21基因敲除后,WT和miR-21敲除的1#、2#、5#K562单细胞克隆对伊马替尼的IC50值分别为1.26±0.09μm/ml和1.56±0.22μm/ml（P=0.1475）、1.13±0.20μm/ml（P=0.4322）、1.18±0.11μm/ml（P=0.4470）,对达沙替尼的IC50值分别为206.27±6.95nm/ml和99.36±1.63nm/ml（P﹤0.05）、84.69±3.46nm/ml（P﹤0.05）、101.49±2.47nm/ml（P﹤0.05）,单细胞克隆对伊马替尼的敏感性和WT相比未见提高,而单细胞克隆对达沙替尼的敏感性和WT相比分别提高了2.08、2.44、2.03倍。miR-21基因敲除后,WT和miR-21敲除的1#、2#、6#KG单细胞克隆对伊马替尼的IC50值分别为21.92±1.36μm/ml和3.98±0.39μm/ml（P﹤0.05）、5.38±1.01μm/ml（P﹤0.05）、9.24±1.36μm/ml（P﹤0.05）,对达沙替尼的IC50值分别为31.41±3.29μm/ml和6.70±0.70μm/ml（P﹤0.05）、5.38±0.33μm/ml（P﹤0.05）、13.54±0.49μm/ml（P﹤0.05）,单细胞克隆对伊马替尼的敏感性和WT组相比分别提高了5.50、4.08、2.37倍,单细胞克隆对达沙替尼的敏感性和WT组相比分别提高了4.69、5.84、2.32倍。6.Annexin V-APC/7-AAD双染流式细胞检测结果显示:K562、KG细胞的WT和miR-21敲除单细胞克隆的早期凋亡率均随着TKIs剂量的增加而增加,呈现出剂量相关的反应模式。在相同浓度的达沙替尼（64、128nmol/ml）作用下,miR-21敲除的1#、2#、5#K562单细胞克隆的早期凋亡率较WT更高,然而在相同浓度的伊马替尼（0.2、0.4μm/ml）作用下,两者之间无明显差异。在相同浓度的伊马替尼（2、4μm/ml）作用下,miR-21敲除的1#、2#、6#KG单细胞克隆的早期凋亡率较WT更高。7.Western blot结果显示:miR-21敲除的K562单细胞克隆中,公认的miR-21的下游靶基因PTEN的蛋白表达水平无明显变化,AKT蛋白表达也无变化,而P-AKT、PI3K、P210BCR-ABL、P-P210BCR-ABL蛋白表达明显下调。miR-21敲除的KG单细胞克隆中,公认的miR-21的下游靶基因PTEN的蛋白表达水平无明显变化,AKT、PI3K也无变化,而P-AKT、P-PI3K、P210BCR-ABL、P-P210BCR-ABL蛋白表达明显下调。结论1.成功建立了miR-21基因敲除的K562、KG单细胞克隆。2.敲除miR-21基因可以抑制K562、KG细胞增殖,能够提高K562、KG细胞对TKIs的敏感性。进一步机制研究表明,这可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路活化和BCR-ABL表达实现的。